PCR擴(kuò)增16srRNA基因以快速診斷敗血癥及分型細(xì)菌.pdf

1、敗血癥是細(xì)菌進(jìn)入血液引起的一種嚴(yán)重的全身感染性疾病,病情進(jìn)展迅速,病死率高,早期診斷和有效的治療對(duì)病人預(yù)后至關(guān)重要。目前敗血癥的確診主要依靠血培養(yǎng)結(jié)果,但血培養(yǎng)方法陽(yáng)性率低,耗時(shí)長(zhǎng),滯后于臨床的需求,導(dǎo)致臨床診斷困難。在治療方面,由于不能明確病原體,也只能先期應(yīng)用大量廣譜抗生素治療,導(dǎo)致耐藥性致病菌的增加和病人負(fù)擔(dān)的加重,所以快速診斷敗血癥并對(duì)細(xì)菌初步分型是臨床亟待解決的難題。
　　 16SrRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA

2、相對(duì)應(yīng)的DNA序列,存在于所有細(xì)菌等原核生物中,但不存在于病毒、真菌等非原核生物中。16SrRNA基因高度保守,但這種保守是相對(duì)的,在其保守區(qū)之間存在9或10個(gè)變異區(qū),可變區(qū)和保守區(qū)交叉排列組成,保守區(qū)序列在所有細(xì)菌菌種中高度一致,而可變區(qū)序列則隨菌種的不同有較大的變化。本研究針對(duì)16SrRNA基因這一特點(diǎn),在保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物,在可變區(qū)設(shè)計(jì)革蘭陽(yáng)性與陰性特異引物,利用PCR技術(shù)快速診斷敗血癥并對(duì)致病菌初步分型,為臨床診治提供病原學(xué)依據(jù)

3、。
　　 1.敗血癥的快速診斷
　　 1.1在16SrRNA基因的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)通用引物,對(duì)引起敗血癥的常見(jiàn)細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌、腐生葡萄球菌)及陰性對(duì)照菌(新型隱球菌、白色念珠菌)和乙肝病毒進(jìn)行擴(kuò)增。陽(yáng)性菌株均得到特異陽(yáng)性條帶,陰性質(zhì)控未出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。
　　 1.2優(yōu)化聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法并通過(guò)不同濃度細(xì)菌來(lái)檢測(cè)方法的靈敏度,PCR方法的最低檢測(cè)濃度可達(dá)到1.

4、5×103CFU/L,顯著高于血培養(yǎng)方法。
　　 1.3檢測(cè)60例敗血癥患者及20例正常人血液標(biāo)本中的16SrRNA基因,與血培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較,PCR方法陽(yáng)性率86.6％,血培養(yǎng)陽(yáng)性率38.3％,PCR方法的陽(yáng)性率明顯高于血培養(yǎng),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 1.4隨機(jī)選取10份血培養(yǎng)陰性而PCR陽(yáng)性血液標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序,其中8份標(biāo)本通過(guò)序列比對(duì),鑒定出了標(biāo)本中的細(xì)菌種屬。
　　 2.細(xì)菌的初步分型

5、>　　 2.1在16SrRNA基因的可變區(qū)分別設(shè)計(jì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌特異性引物,分別對(duì)革蘭陽(yáng)性菌株(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、腸球菌)和革蘭陰性菌(大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌)進(jìn)行巢式PCR得到特異性條帶。
　　 2.2對(duì)20例血培養(yǎng)陽(yáng)性血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),得到的結(jié)果與血培養(yǎng)鑒定結(jié)果一致。
　　 本研究結(jié)果表明,利用PCR擴(kuò)增16SrR