Nested PCR法擴(kuò)增16SrRNA基因動(dòng)態(tài)檢測(cè)肺炎支原體的臨床意義.pdf

1、目的：
　　 肺炎支原體（MP）是兒童和青少年呼吸道感染常見的病原體，由于兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育期，治療兒童MP感染的藥物首選大環(huán)內(nèi)酯類。目前許多學(xué)者均認(rèn)為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的療程不可少于2-3周，這僅來自于我們臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，尚缺少病原學(xué)方面的依據(jù)。直接檢出病原體為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但分離培養(yǎng)法條件要求嚴(yán)格，耗時(shí)長(zhǎng)，陽(yáng)性率低等缺點(diǎn)被限制應(yīng)用于臨床。本文對(duì)肺炎支原體肺炎（MPP）患兒，于不同病程時(shí)相分別采集咽試子，采用巢式聚合酶鏈反應(yīng)（ne

2、sted PCR）方法，擴(kuò)增具有種屬特異性的16SrRNA基因，檢測(cè)咽試子標(biāo)本中的MP-DNA，記錄MP-DNA消失時(shí)間，擬依據(jù)MP-DNA消失時(shí)間結(jié)合臨床表現(xiàn)，作為病原學(xué)方面的參考及結(jié)合臨床表現(xiàn)，指導(dǎo)臨床大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的療程。
　　 材料和方法
　　 一、研究對(duì)象
　　 1、實(shí)驗(yàn)組
　　 2008年11月～2009年8月于我院兒科呼吸病房住院的肺炎患兒。根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)和剔除標(biāo)準(zhǔn)入選的患兒共100例：男5

3、7例，女53例；年齡3月-14歲（平均年齡5.3歲）；普通型組40例，重型組60例（依據(jù)趙順英重型MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)）；高抗體組58例，低抗體組42例（MP-Ab≥1:1280高抗體，≤1:640為低抗體）
　　 2、正常對(duì)照組
　　 同期我院兒童保健門診取無呼吸道感染的20例健康兒童咽拭子作為對(duì)照組，男12例，女8例，年齡3歲-10歲（平均年齡5歲），年齡及性別構(gòu)成比與實(shí)驗(yàn)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 二、標(biāo)本采集

4、>　　 用無菌生理鹽水浸濕的無菌咽拭子適度用力擦拭患兒咽后壁，標(biāo)記明確后于-80℃低溫保存?zhèn)溆?，同時(shí)抽血1ml低溫保存，用于微量顆粒凝集法（PA）檢測(cè)MP抗體（MP-Ab）。每間隔1周用同樣方法采集患兒咽試子復(fù)查MP-DNA及MP-Ab，直至MP-DNA陰性，停止復(fù)查。
　　 三、主要儀器和試劑
　　 PCR儀、高速低溫離心機(jī)、電泳儀、超凈工作臺(tái)、震蕩儀、干浴鍋；taq DNA聚合酶、dNTP，引物，MP-DNA裂解液

5、.
　　 四、方法
　　 1、Nested-PCR擴(kuò)增
　　 （1）DNA提取
　　 （2）以16SrRNA為靶基因，設(shè)計(jì)2套引物，進(jìn)行nested PCR擴(kuò)增。
　　 （3）電泳觀察結(jié)果
　　 （4）統(tǒng)計(jì)分析
　　 2、PA法檢測(cè)MP-Ab，按說明書操作，檢測(cè)結(jié)果為MP總抗體（IgG及IgM）滴度。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、擴(kuò)增16SrRNA基因檢測(cè)MP-DNA

6、與常規(guī)PA法檢測(cè)MP-Ab比較，二者陽(yáng)性率一致，Nested PCR法檢出陽(yáng)性結(jié)果早于PA法。
　　 2、20例健康對(duì)照組Nested PCR法擴(kuò)增16SrRNA基因檢測(cè)MP-DNA均為陰性。
　　 3、Nested PCR法擴(kuò)增16SrRNA基因動(dòng)態(tài)檢測(cè)100例MPP患兒，MP-DNA消失時(shí)間的中位數(shù)為5周，95％的MPP患兒體內(nèi)MP-DNA消失時(shí)間大于3周。100例MPP患兒有78例（占78％）MP-DNA消失時(shí)間在

7、發(fā)病后3～6周。
　　 4、普通型MPP患兒MP-DNA存在時(shí)間的中位數(shù)是發(fā)病后4周，重型組MP-DNA存在時(shí)間的中位數(shù)是發(fā)病后6周。重型MPP的患兒MP-DNA存在時(shí)間長(zhǎng)于普通型，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間差異。
　　 5、重型MPP患兒予丙種球蛋白（IVIG）400-500 mg/Kg/d，連用3天，應(yīng)用IVIG
　　 6、治療組MP-DNA消失時(shí)間的中位數(shù)是5周，未用組MP-DNA消失時(shí)間的中位數(shù)是6周，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，

8、組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7、MP-Ab高低與MP-DNA消失時(shí)間平均周數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間無差異，但MP-DNA消失時(shí)間≥7周患兒中以高M(jìn)P抗體者為主（16/20），MP-DNA消失時(shí)間≤4周和≥7周兩組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高M(jìn)P抗體組MP-DNA存在時(shí)間更長(zhǎng)。
　　 8、年齡性別與體內(nèi)MP-DNA消失時(shí)間無相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1、Nested-PCR法擴(kuò)增16SrRNA檢測(cè)MP-

9、DNA，靈敏度與常規(guī)Mp-Ab檢測(cè)相同，特異性高于常規(guī)Mp-Ab檢測(cè)，不受感染時(shí)間的限制，可作為早期確診MP感染的病原學(xué)依據(jù)，且有助于既往MP感染的診斷。
　　 2、MP-DNA消失時(shí)間大部分在3周-6周。重型MPP患兒MP-DNA存在時(shí)間大于普通型MPP。依據(jù)MP-DNA消失時(shí)間及臨床表現(xiàn)，考慮普通型MPP臨床大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的療程3-4周，重型MPP療程4-6周。
　　 3、在重型MPP急性期予IVIG治療，可能會(huì)縮