食管鱗癌高表達趨化因子鑒定及T細胞趨化運動研究.pdf

1、目的
　　食管癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性消化道腫瘤之一，是威脅人類生存的一大殺手，盡管近年來隨著科學技術(shù)發(fā)展，治療食管癌的手段有所提高，但是患者5年生存率仍低于20％。文獻報道，T細胞亞群歸巢到腫瘤部位的能力與患者預后相關(guān);CD8+T細胞在清除外來物質(zhì)和腫瘤細胞過程中發(fā)揮重要作用，其歸巢能力與患者預后正相關(guān)，而調(diào)節(jié)性T細胞歸巢到腫瘤部位則抑制殺傷性T細胞功能，其歸巢能力與患者預后負相關(guān)。研究報道顯示，惡性黑色素瘤患者體內(nèi)趨化因子通過

2、與其受體相互作用，在T細胞歸巢過程中發(fā)揮重要作用。但是尚未揭示T細胞在食管癌患者體內(nèi)的歸巢機制，探討T細胞亞群歸巢至食管癌組織的分子機制將會對改進CIK療法提供重要理論依據(jù)。本研究以食管癌患者標本為研究對象，探討在腫瘤部位高表達趨化因子，并對腫瘤部位高表達趨化因子與浸潤T細胞進行相關(guān)性分析;檢測高表達趨化因子相應受體在食管癌患者外周血和組織浸潤性淋巴細胞中所占比例，并探討這些高表達趨化因子的主要來源;體外驗證趨化因子對T細胞遷移運動的影

3、響。CIK療法是新興免疫療法，在取得一定臨床效果的同時少數(shù)患者對該療法呈無應答狀態(tài)，動物實驗表明CIK細胞歸巢能力可能是決定其臨床療效的重要因素之一。探討T細胞歸巢過程的分子機制將會對改進CIK臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法
　　鄭州大學第一附屬醫(yī)院收集食管癌患者標本。采用RT-PCR法檢測趨化因子CCL2/CCL4/CCL5/CCL8/CCL11/CCL17/CCL20/CCL21/CCL22/CXCL10/CXCL12

4、在食管癌組織和癌旁組織表達;此外還檢測食管癌組織中T細胞表型markerCD4/CD8/FoxP3和功能因子IL-10/Perforin/GranzymeB在基因水平的表達。免疫組化技術(shù)檢測食管癌組織高表達趨化因子并分析其主要分泌來源。使用密度梯度離心法，F(xiàn)icoll-Plaque淋巴細胞分離液分離提取食管癌患者外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)和腫瘤組織中浸潤性T細胞(tumor

5、infiltratinglymphocytes，TIL)，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?采用流式細胞術(shù)檢測T細胞亞群及高表達趨化因子相應受體在外周血單個核細胞和腫瘤浸潤性T細胞中比例。新鮮分離獲得的食管癌患者外周血單個核細胞，先采用磁分選技術(shù)純化富集T細胞，然后體外使用Transwell技術(shù)檢測趨化因子對T細胞遷移運動能力的影響。
　　結(jié)果
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示，趨化因子CCL4/CCL20/CXCL10在食管癌組織中

6、的表達高于癌旁部位，差異有統(tǒng)計學意義;而趨化因子CCL2/CCL5/CCL8/CCL11/CCL17/CCL21/CCL22/CXCL12表達在腫瘤組織和癌旁組織差異無統(tǒng)計學意義。與之相一致，免疫組化結(jié)果顯示CCL4/CCL20/CXCL10在癌組織高表達，且腫瘤細胞是趨化因子的主要來源。
　　2.相關(guān)性分析結(jié)果顯示，食管癌組織中，趨化因子CCL4和CXCL10均與CD8/Perforin/GranzymeB的表達正相關(guān)，而趨化因

7、子CCL20與CD4/FoxP3以及抑制性因子IL-10的表達正相關(guān)。
　　3.流式結(jié)果顯示，CD8+T細胞在食管癌腫瘤浸潤性T細胞所占比例高于外周血單個核細胞;總CD4+T細胞在腫瘤浸潤性T細胞中所占比例低于外周血單個核細胞但是CD4+Foxp3+T細胞亞群在腫瘤浸潤性T細胞積聚;與基因結(jié)果相一致，腫瘤浸潤性T細胞中趨化因子受體CCR5和CXCR3在CD8+T細胞上所占比例高于外周血單個核細胞而CCR6+CD4+Foxp3+T細

8、胞比例在腫瘤浸潤性T細胞中大大升高。
　　4.體外Transwell實驗結(jié)果顯示，人工合成的趨化因子CCL4，CCL20和CXCL10均增強T細胞遷移運動能力;收集下室細胞，流式分析結(jié)果顯示，CCL4和CXCL10主要招募CD8+T細胞而CCL20主要招募CD4+Foxp3+T細胞亞群。
　　結(jié)論
　　趨化因子CCLA/CCL20/CXCL10在食管鱗癌患者腫瘤組織中高表達，分別影響了表達相應受體的CD8+T和CD4+