獲得性大皰性表皮松解癥的實驗診斷.pdf

1、目的:對經(jīng)過常規(guī)手段診斷為大皰性類天皰瘡(BP)的37例患者的血清進行回顧性研究以確定獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)在該組人群中的發(fā)生率,對4例BP患者唾液進行檢測以確定唾液中是否存在抗基底膜帶(BMZ)抗體.方法一、標本資料1、血清:37例BP患者血清,來自1995年至2003年就診于中國醫(yī)科大學附屬一院皮膚科的BP(根據(jù)臨床表現(xiàn)、病理、直接免疫熒光(DIF)診斷為大皰性類天皰瘡)患者,其中男20例,女17例,年齡20-85歲,平均

2、年齡62.1歲.10例正常人血清來自獻血員.2、唾液:4例BP患者唾液,其中男2例,女2例,年齡54-85歲,平均年齡69.3歲.4例正常人唾液.3.正常人皮膚標本:來源于新鮮的乳腺切除術(shù)及美容整形術(shù)后正常皮膚.二、方法(一)間接免疫熒光(IIF)1、常規(guī)IIF底物為正常人皮膚,第一抗體為血清及唾液,第二抗體為異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗人IgG.熒光顯微鏡觀察結(jié)果.2.鹽裂正常人皮膚IIF新鮮正常人皮膚置于1mol/1NaCl

3、溶液中,4℃,每24小時換液一次,經(jīng)72小時即用OCT包埋,余同常規(guī)IIF.(二)WesternBlot(免疫印跡(IB))1、真表皮分離方法取新鮮外科術(shù)后正常皮膚標本,盡量去除皮下脂肪組織并削成0.5mm左右厚度,分離真表皮采用1mol/1NaCl法,NaCl溶液中含1mmol/1PMSF、2mmol/1EDTA,4℃,每24小時換液一次,72小時后取出,用鑷子輕輕分離表皮和真皮.2.蛋白質(zhì)提取方法表皮剪碎,置于表皮抗原提取液中(65

4、mmol/1Tris-HCL pH6.8內(nèi)含2﹪SDS、5﹪2-ME、10mmol/lEDTA、2mmol/lPMSF及pepstatin A、antipain、leupeptin、Chymostatin各0.01mg/ml),按25cm<'2>表皮加1ml表皮抗原提取液,在勻漿機內(nèi)勻漿,然后超聲(A=60,C=0.5)30",15000轉(zhuǎn)/分離心,4℃,30',收集上清,此為表皮抗原提取物,-20℃保存?zhèn)溆?真皮剪碎,置于真皮抗原提取

5、液中(31.2mmol/lTris-HCl pH6.8內(nèi)含8mol/l尿素、2﹪SDS、5﹪2-ME、10mmol/l EDTA、10mmol/lPMSF),按15cm<'2>真皮加1ml真皮抗原提取液,室溫下振蕩1小時,然后4℃過液(16小時),以15000轉(zhuǎn)/分離心,4℃,1小時,收集上清,此為真皮抗原提取物,-20℃保存?zhèn)溆?3.平板電泳(SDS-PAGE)真皮和表皮蛋白提取物進行SDS-PAGE,分離膠濃度為6﹪,積層膠濃度3﹪

6、,用穩(wěn)壓電泳,積層膠50V,分離膠100V,約2小時.4.轉(zhuǎn)膜半干式蛋白轉(zhuǎn)印法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上.5.免疫印跡將硝酸纖維素膜剪成2mm寬,加入反應(yīng)槽中,用封閉液(50mmol/lTris-HCl、5﹪脫脂奶粉pH7.4)在室溫下封閉2小時.棄去封閉液,加血清稀釋液(50mmol/lTris-HCL、0.5mol/lNaCl、5﹪脫脂奶粉、0.3﹪Tween20pH7.4)1:100稀釋的待測血清及1:2稀釋的待測唾液,

7、37℃,1小時,用洗滌液(10mmol/lTris-HC1、0.5mol/1NaCl、0.3﹪Tween20pH7.4)漂洗10'×4,加血清稀釋液1:2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG,重復(fù)加待測血清或唾液后步驟,甩干后加DAB底物液,觀察棕色帶出現(xiàn).結(jié)論:1.EBA在經(jīng)過常規(guī)方法診斷為BP的患者中的發(fā)生率為5.4﹪首次發(fā)現(xiàn)1例IB示結(jié)合真皮側(cè)290KD蛋白抗原分子而1mol/lNaCl鹽裂皮膚IIF為表皮側(cè)染色的EBA.