重組人Ⅶ型膠原蛋白對營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥治療作用的實驗研究.pdf

1、前言：
　　營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥（Dystrophic Epidermolysis Bullosa，DEB）是一類由人體VII類蛋白基因（Type VII Collagen，C7）突變或缺失引起的機械性大皰性疾病。其特征是易受損的皮膚，真表皮脫離甚至剝落導(dǎo)致水皰的形成，從而留下瘢痕。不僅如此，病人常常會因為皮膚的反復(fù)潰爛而導(dǎo)致四肢的殘缺，還會因為口腔粘膜和食道的潰爛導(dǎo)致進食飲水的困難。由此，長期的皮膚及粘膜反復(fù)潰爛結(jié)疤會發(fā)展

2、成惡性鱗狀上皮細(xì)胞癌。多數(shù)患者在年幼時因為該疾病而早夭。DEB分為營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥亞型（DDEB）和隱性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥亞型（RDEB）兩種。
　　DEB已給數(shù)以千計的家庭帶來痛苦。在這些病人中有超過三百種不同的C7變異亞型。C7基因的突變導(dǎo)致了錨原纖維合成和裝配的異常，以及真表皮之間的黏附。最嚴(yán)重的DEB亞型為隱性DEB（the Hallopeau-Siemens型，HS-RDEB），其C7及錨原纖維均缺失。

3、所以，HS-RDEB表征為嚴(yán)重的皮膚水皰，極易受損的皮膚，多層瘢痕引起的手足殘缺、關(guān)節(jié)攣縮和食道狹窄。HS-RDEB病人在其二十至四十歲期間由于長期性的皮膚創(chuàng)傷會引發(fā)侵襲性鱗狀細(xì)胞癌而導(dǎo)致癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移乃致死亡。
　　C7是錨原纖維的主要成分，而錨原纖維則是皮膚基底膜帶用來“連接”真皮與表皮的附屬結(jié)構(gòu)。C7基因由三條相同的α鏈組成，每條α鏈都包括了一個大小為145kDa，重復(fù)編碼為Gly-X-Y的膠原性氨基酸三螺旋結(jié)構(gòu)，一個145k

4、Da的非膠原性片斷位于氨基端（NC1），羧基端也是一個非膠原性片斷，不過大小只有34kDa（NC2）。NC1基端被公認(rèn)為可作用于BMZ的一端，并且也是IV膠原蛋白的氨基終端。
　　本實驗運用具有免疫活性的不表達(dá)COL7A1基因敲除小鼠模型（其臨床癥狀類似于人類RDEB患者），采用分子生物學(xué)和免疫學(xué)等實驗研究技術(shù)，探討和研究了C7蛋白基因?qū)z傳性RDEB的治療作用，為C7蛋白基因藥物的進一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　1、研究目的：<

5、br>　　研究重組人C7基因的體內(nèi)、外表達(dá)；為DEB的治療提供臨床前研究實驗依據(jù)。
　　2、實驗方法：
　　2.1、重組C7外表達(dá)的修復(fù)
　　2.1.1、細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM/Ham’sF12（1:1）培養(yǎng)基中，永生化培養(yǎng)RDEB成纖維細(xì)胞(原代RDEB成纖維細(xì)胞來自于斯坦福大學(xué)的S.Herron)，培養(yǎng)箱溫度為37°C，及5％CO2。
　　2.1.2、慢病毒載體的基因轉(zhuǎn)染將全長8850bp的C7

6、基因亞克隆進入慢病毒轉(zhuǎn)染載體SMPU的聚合接點序列，且恰好位于內(nèi)部啟動子MND的下游，然后將構(gòu)建好的攜帶有C7的病毒轉(zhuǎn)染入RDEB成纖維細(xì)胞。
　　2.1.3、免疫熒光染色以免疫熒光染色法檢驗RDEB成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染質(zhì)量。
　　2.1.4、C7的純化及分析免疫印跡實驗中，經(jīng)轉(zhuǎn)染的RDEB成纖維細(xì)胞長到匯合，加入含150μM的抗壞血酸條件培養(yǎng)液中生長24小時。收集培養(yǎng)液，加入絲氨酸蛋白酶抑制劑，用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳法定量定

7、性。Western印跡測試中，我們用C7的NC1域作為多克隆抗體由而探測到C7的存在。在大量純化重組C7中，含有絲氨酸蛋白酶抑制劑和硫酸銨的無血清培養(yǎng)液攪拌過夜，透析，然后離心使不溶物質(zhì)沉淀，再將沉淀物重新溶解，過Q-瓊脂糖（Amersham Biosciences，Inc.），NaCl線性梯度洗脫，最終C7保存于1M-NaCl中。
　　2.2、重組C7體內(nèi)表達(dá)的修復(fù)
　　2.2.1、C7顯性缺失小鼠的鑒別C7顯性缺失小鼠（

8、C57B/L系列）也被稱為DEB小鼠，在其出生之后即可從爪部和/或腹部的紅色水泡辨別其特征。
　　2.2.2、C7隱性缺失小鼠的鑒別C7隱性缺失小鼠必須采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）才能確認(rèn)其基因型。
　　2.2.3、C7對C7顯性缺失小鼠的治療每日在DEB小鼠的背部皮下注射一定量的COL7A1（C7），根據(jù)小鼠存活時間（4天至7個月不等），累計注射到每只DEB小鼠的C7量從20μgto300μg不等。
　　2.2.4、皮

9、膚組織的免疫熒光染色及超微結(jié)構(gòu)分析嵌入OCT中的組織在低溫保持器中切成5μm厚，以丙酮固定，然后用能識別小鼠C7及人C7的兔多克隆抗體進行培育，再用摻有CY3的羊抗兔IgG抗體結(jié)合。樣本用40％的甘油隔絕空氣之后，Zeiss Axioplan熒光顯微鏡和Zeiss Axiocam MRM數(shù)碼相機完成檢測及拍攝。
　　2.2.5、重組NC1的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）體循環(huán)中產(chǎn)生的抗C7抗體用ELISA法測定。不同時間點從6只注

10、射了C7的DEB小鼠提取血清，以NCL作參比對照，分析抗C7抗體的濃度。
　　2.2.6、治療組MR1和對照組IgG比較3只DEB小鼠腹腔注射MR1，其對照組的3只DEB小鼠注射倉鼠IgG?；谥暗膱蟮?，我們展開了MR1的劑量反應(yīng)研究。首日2×10-2μg/kg，第2，4，7，14，21，28天劑量依次為1×10-2μg/kg。每月收集一次血清樣本，ELISA法定量。
　　3、實驗結(jié)果：
　　3.1、重組VII膠原蛋

11、白體外表達(dá)的修復(fù)
　　3.1.1、運用慢病毒載體進行基因轉(zhuǎn)染全長8850bp的C7基因被亞克隆進慢病毒轉(zhuǎn)染載體SMPU的聚合接點序列，且恰好位于內(nèi)部啟動子MND的下游。經(jīng)轉(zhuǎn)染的RDEB成纖維細(xì)胞也攜帶C7的cDNA。
　　3.1.2、免疫熒光染色細(xì)胞95％呈陽性結(jié)果，熒光顯微鏡下檢測，之后拍照。
　　3.1.3、C7的純化及分析Western印跡法和coomassie藍(lán)染色法定性和定量及純化C7。
　　3.2、重

12、組C7體內(nèi)表達(dá)的修復(fù)
　　3.2.1、C7顯性缺失小鼠的鑒別采用C7治療。
　　3.2.2、C7隱性缺失小鼠的鑒別C7隱性缺失小鼠被用來繁殖。
　　3.2.3、C7對C7顯性缺失小鼠的治療C7注射兩到三次后，小鼠水皰癥狀減輕，并無新水皰形成。
　　3.2.4、皮膚組織的免疫熒光染色及超微結(jié)構(gòu)分析經(jīng)染色的基底膜帶可觀測到陽性反應(yīng)，錨原纖維結(jié)構(gòu)得到矯正以及重新形成，由此可以證明DEB小鼠皮膚組織中主要的超微結(jié)構(gòu)異常得