大皰性類天皰瘡并獲得性FⅧ抑制物的臨床特點(diǎn)、免疫學(xué)特性及FⅧ結(jié)合表位研究.pdf

1、研究背景： 獲得性凝血因子Ⅷ(FⅧ)抑制物是一種罕見的出血性疾病，因循環(huán)中產(chǎn)生抗FⅧ：C抗體所致。人群發(fā)病率約0．2～1/100萬/年。該病發(fā)病年齡較大，發(fā)生率無明顯性別差異，臨床表現(xiàn)以皮膚及肌肉出血、血尿、胃腸道出血、產(chǎn)后或術(shù)后出血不止等常見，關(guān)節(jié)出血少見?；颊叱鲅Y狀重，對(duì)常規(guī)的FⅧ替代治療反應(yīng)差，常危及生命，大約16％～22％的獲得性FⅧ抑制物患者死于嚴(yán)重出血。獲得性FⅧ抑制物的發(fā)病機(jī)理尚未闡明，多種疾病均可導(dǎo)致獲得性FⅧ

2、抑制物的發(fā)生，但約50％患者無任何原發(fā)疾病。繼發(fā)于大皰性類天皰瘡的獲得性FⅧ抑制物較罕見，迄今國際上僅報(bào)道8例，且僅限于臨床分析，國內(nèi)尚未見類似研究的文獻(xiàn)報(bào)道。國外研究表明：歐美人種獲得性FⅧ抑制物大多數(shù)為IgG型抗體，IgA或IgM型罕見。IgG型抗體為多克隆或雙克隆起源，以IgG<,4>的優(yōu)勢(shì)表達(dá)為主，伴IgG<,1>或其它至少一種亞型表達(dá)。國際上對(duì)獲得性FⅧ抑制物的研究集中在抑制物的免疫特性分析及抑制物作用FⅧ的結(jié)合表位研究。文獻(xiàn)

3、報(bào)道獲得性FⅧ抑制物與FⅧ的結(jié)合部位以A2、A3、C2區(qū)域多見，其中FⅧ羧基端44KD和氨基端72KD片段為FⅧ抑制物的具體結(jié)合位點(diǎn)。本課題以 1 例大皰性類天皰瘡并獲得性FⅧ抑制物患者為研究對(duì)象，綜合分析患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)，確定了該患者獲得性FⅧ抑制物的臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷；對(duì)該例患者我們應(yīng)用了血漿置換治療，從臨床癥狀、FⅧ：C活性及FⅧ抑制物滴度改變等方面動(dòng)態(tài)觀察了血漿置換的治療效果；通過對(duì)FⅦI:C體外中和實(shí)驗(yàn)及“短暫性”獲得

4、性FⅧ抑制物動(dòng)物模型的建立，證實(shí)患者體內(nèi)的FⅧ抑制物對(duì)FⅧ：C具有明顯的中和拮抗作用，從而強(qiáng)化了該病的臨床診斷；應(yīng)用散射速率比濁法及免疫印跡技術(shù)分析測(cè)定了患者體內(nèi)IgG亞型濃度，獲得了該患者FⅧ抑制物的IgG亞型分布譜；通過FⅧ/FⅧ抑制物固相結(jié)合及免疫印跡技術(shù)分析，鑒定了FⅧ抑制物IgG亞型及與FⅧ分子的結(jié)合表位，從而部分闡明了中國人種FⅧ抑制物的免疫學(xué)特性，也揭示了FⅧ抑制物發(fā)病的部分機(jī)制；為該病的臨床特點(diǎn)認(rèn)識(shí)、實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)及臨床處理

5、積累了新的經(jīng)驗(yàn)。 第一部分大皰性類天皰瘡并獲得性FⅧ抑制物患者的臨床特點(diǎn)及診斷。 目的：分析大皰性類天皰瘡并獲得性FⅧ抑制物患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)，確定獲得性FⅧ抑制物的診斷，以加深對(duì)獲得性FⅧ抑制物的認(rèn)識(shí)，提高對(duì)該病的診斷水平及治療緩解率。 方法：①對(duì)患者的臨床出血表現(xiàn)、出血病史、家族史及原發(fā)病病史進(jìn)行詳細(xì)采集與分析；②進(jìn)行活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血活酶生成及糾正試驗(yàn)、血小板聚

6、集功能等實(shí)驗(yàn)室檢查；用Ⅰ期法測(cè)定患者血漿FⅧ：C活性；以Bethesda，單位(BU)確定FⅧ：C抑制物滴度；③用免疫抑制劑及血漿置換治療，觀察患者臨床癥狀的改善與否，并監(jiān)測(cè)FⅧ：C活性與FⅧ抑制物滴度變化，以判斷臨床治療效果。結(jié)果：①患者的臨床表現(xiàn)符合FⅧ缺乏的臨床特點(diǎn)，此次起病前曾患大皰性類天皰瘡，此后出現(xiàn)不明原因的多部位出血?；颊呒韧鶡o出血史及出血家族史，故出血性疾病顯然為獲得性因素所致。②凝血機(jī)制實(shí)驗(yàn)室檢查 結(jié)果：患者

7、APTT:80.5″，(正常對(duì)照：25″～35″)，正常血漿不能糾正，PT:12″，(正常對(duì)照：11″～14″)，凝血活酶生成及糾正試驗(yàn)示FⅧ：C 缺乏；Ⅰ期法測(cè)定患者FⅧ：C活性<1.5％，F(xiàn)Ⅷ抑制物滴度為147.8 BU；③強(qiáng)的松結(jié)合環(huán)磷酰胺及血漿置換治療后，患者臀部血腫逐漸吸收，四肢皮下瘀斑消退，出血癥狀明顯緩解，F(xiàn)Ⅷ：C活性上升至13.2％；FⅧ抑制物效價(jià)下降至28 BU。 結(jié)論：①確定了大皰性類天皰瘡并獲得性FⅧ抑制物

8、的臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷。APTT及PT測(cè)定可作為出血性疾病的初篩試驗(yàn)，進(jìn)一步的APTT糾正試驗(yàn)、凝血活酶生存及糾正試驗(yàn)、FⅧ：C活性定量及FⅧ抑制物滴度測(cè)定可明確獲得性FⅧ抑制物的診斷；②免疫抑制劑及血漿置換是治療獲得性FⅧ抑制物的有效方法。 第二部分：FⅧ抑制物對(duì)正常人血漿FⅧ的抑制作用及對(duì)兔體內(nèi)FⅧ活性的影響。 目的：純化患者及正常人血漿IgG；通過體外中和試驗(yàn)及動(dòng)物體內(nèi)FⅧ：C抑制實(shí)驗(yàn)證明患者體內(nèi)FⅧ抑制物對(duì)正常人血漿

9、及兔FⅧ：C活性的影響。 方法：①用蛋白A-瓊脂糖柱分離純化患者及正常人血漿IgG；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定純化的血漿IgG純度及分子量大??；②將純化的患者IgG以不同濃度(0μg，6.25μg，12.5μg，25μg，50μg，75μg)加入正常人混合血漿中，APTT法分析其對(duì)正常人血漿FⅧ：C活性的抑制作用，以等量純化的正常人IgG加入正常人混合血漿作APTT以資對(duì)照；③輸注患者血漿入健康新西蘭兔體

10、內(nèi)，測(cè)定注射血漿前30′及注射血漿后30′、60′、90′、120′時(shí)間點(diǎn)兔血漿APTT，觀察FⅧ抑制物對(duì)兔血漿APTT值的影響，以等量正常人血漿注入新西蘭兔作為對(duì)照。 結(jié)果：①獲得了純化的患者及正常人血漿IgG，其分子量大小為55KD(重鏈)和28KD(輕鏈)；②加入患者純化的IgG后，可使正?；旌涎獫{的APTT、值明顯延長，并呈IgG劑量依賴性，純化的正常人IgG不延長正常人混合血漿APTT值；③輸注患者血漿入新西蘭兔體內(nèi)，

11、兔血漿APTT明顯延長，且以時(shí)間依賴性方式抑制兔血漿FⅧ：C活性，輸注正常人血漿對(duì)兔APTT值無明顯影響。 結(jié)論：該大皰性類天皰瘡并獲得性FⅧ抑制物患者體內(nèi)FⅧ抑制物抗體類型為IgG；該抗體在體內(nèi)外均有明顯抑制FⅧ：C活性的作用，從而強(qiáng)化了獲得性FⅧ抑制物的臨床診斷。 第三部分：獲得性FⅧ抑制物的I gG亞型分析及FⅧ結(jié)合表位鑒定。 目的：分析患者血漿及純化的IgG各亞型(IgG<,1>、IgG<,2>、IgG<

12、,3>、IgG<,4>)濃度；鑒定FⅧ抑制物的IgG亞型；確定患者FⅧ抑制物“中和”FⅧ：C活性的結(jié)構(gòu)性表位，揭示該病發(fā)病的分子機(jī)制。 方法：①用人免疫球蛋白IgG亞型測(cè)定試劑盒，以散射速率比濁法分別測(cè)定患者及正常人血漿各IgG亞型濃度；②Western印跡技術(shù)結(jié)合灰度掃描確定患者血漿IgG亞型相對(duì)表達(dá)量；③用凝血酶消化的FⅧ蛋白，跑SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移膠到PVDF膜，以患者血漿孵育PVDF膜過夜(FⅧ/FⅧ抑制物固相結(jié)合

13、試驗(yàn))，結(jié)合Western印跡技術(shù)，鑒定FⅧ抑制物的免疫亞型及與FⅧ結(jié)合的具體表位，同時(shí)以正常人血漿孵育的PVDF膜作對(duì)照。 結(jié)果：①散射速率比濁法測(cè)定結(jié)果顯示患者血漿及純化的IgG中IgG<,4>濃度較正常人血漿及純化的IgG中IgG<,4>濃度明顯增高；而IgG<,2>及IgG<,3>濃度，患者與正常人基本相似(血漿及純化的 IgG)；患者 IgG<,1>濃度較正常人IgG<,1>濃度輕度增高(血漿及純化的IgG)；②Wes

14、tern印跡結(jié)果顯示患者血漿的 IgG<,4>蛋白條帶灰度值明顯高于正常人血漿 IgG<,4>蛋白印跡條帶灰度值；次為 IgG<,1>；③FⅧ/FⅧ抑制物固相結(jié)合試驗(yàn)及Western印跡結(jié)果顯示：鼠抗人 IgG<,4>、IgG<,1>抗體在FⅧ的44KD片段處存在陽性信號(hào)，提示IgG<,4>、IgG<,1>型抗FⅧ抗體與凝血酶消化的FⅧ裂解片段的44KD位點(diǎn)結(jié)合；用鼠抗人 IgG<,2>、IgG<,3>抗體進(jìn)行上述分析，無論以患者還是正