大皰性類天皰瘡抗原BPAG2T細(xì)胞表位鑒定及基于表位的發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、大皰性類天皰瘡（BP）是皮膚科常見的自身免疫性水皰性皮膚病，主要累及中老年人，慢性病程、病情頑固、易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者身心健康。BP臨床以頑固性水皰大皰為主要特點(diǎn)，組織病理主要表現(xiàn)為表皮下水皰及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的局部浸潤(rùn)，免疫病理則可見基底膜帶IgG抗體和補(bǔ)體C3的線狀沉積。因發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前BP的治療主要依靠系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑控制病情、減少復(fù)發(fā)，但在療效、藥物不良反應(yīng)等方面尚存在較多問題。因此，深入研究B

2、P發(fā)病機(jī)制，探索更為有效、更具針對(duì)性的治療方法顯得尤為重要。
　　目前學(xué)者普遍認(rèn)為，BP的發(fā)病是特異性自身抗體與抗原結(jié)合，引起包括補(bǔ)體活化、肥大細(xì)胞脫顆粒、趨化中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及蛋白水解酶的釋放等在內(nèi)的一系列免疫炎性反應(yīng)，破壞真表皮間的連接，引起表皮下水皰的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，大皰性類天皰瘡抗原2（BPAG2）是BP的主要自身抗原，是位于皮膚基底膜帶的一種跨膜蛋白，其胞外域第16個(gè)非膠原編碼區(qū)（NC16A）是自身

3、反應(yīng)性T細(xì)胞識(shí)別的主要區(qū)域，也是自身抗體結(jié)合的主要區(qū)域，但自身反應(yīng)性T細(xì)胞和自身抗體作用的具體抗原表位尚不明確。進(jìn)一步明確BP抗原表位，并進(jìn)行抗原表位的HLA限制性分析，對(duì)于深入研究BP的發(fā)病機(jī)制、探索更具針對(duì)性的新的治療手段具有重要意義。
　　目的：
　　鑒定BP抗原BPAG2分子的T細(xì)胞表位，分析T細(xì)胞表位的HLA限制性，研究基于表位的抗體產(chǎn)生機(jī)制及免疫應(yīng)答過程，探索BP特異性治療手段。
　　方法：
　?。?

4、）表位作圖法合成重疊肽：以包含BPAG2-NC16A片段全長(zhǎng)的77個(gè)氨基酸（490-566aa）為篩選靶區(qū)域，自N端向C端依次重疊12個(gè)氨基酸，合成22條重疊肽（15肽），直至覆蓋BPAG2-NC16A全長(zhǎng)。
　?。?）Th1細(xì)胞表位的篩查：采用ELISPOT方法，檢測(cè)合成的22條重疊肽刺激BP患者PBMC后分泌細(xì)胞因子IFN-γ的情況，篩選BP患者的Th1細(xì)胞表位。
　?。?）Th2細(xì)胞表位的篩查：采用ELISPOT方法，

5、檢測(cè)合成的22條重疊肽刺激BP患者PBMC后分泌細(xì)胞因子IL-4的情況，篩選BP患者的Th2細(xì)胞表位。
　　（4）T細(xì)胞表位對(duì) CD4+T細(xì)胞增殖的影響：分離肽段反應(yīng)陽性的BP患者PBMC，經(jīng)CFSE染色后用篩選出的T細(xì)胞陽性肽段刺激并培養(yǎng)7天，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的增殖情況。
　?。?）T細(xì)胞表位對(duì)B細(xì)胞活化的影響：用篩選出的T細(xì)胞陽性肽段，同上分別刺激BP患者及健康對(duì)照者PBMC，培養(yǎng)7天后用ELISA方法檢

6、測(cè)培養(yǎng)上清中可溶性CD23水平來反映B細(xì)胞活化情況。
　?。?）T細(xì)胞表位對(duì)抗體產(chǎn)生的影響：用篩選出的T細(xì)胞陽性肽段，同上刺激BP患者及健康對(duì)照者PBMC，培養(yǎng)7天后用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗BPAG2-NC16A抗體產(chǎn)生情況。
　?。?）T細(xì)胞表位擴(kuò)展現(xiàn)象研究：分別抽取同一 BP患者疾病活動(dòng)期及疾病穩(wěn)定期外周血，提取PBMC，用同樣的ELISPOT方法檢測(cè)BP患者不同病期T細(xì)胞表位變化情況，分析其表位擴(kuò)展現(xiàn)象。
　

7、　（8）T細(xì)胞表位的HLA限制性分析：分離肽段反應(yīng)陽性的BP患者PBMC，分別預(yù)先加入HLA-ABC、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR中和抗體，然后用篩選出的陽性肽段進(jìn)行刺激，根據(jù)刺激后的反應(yīng)情況明確其HLA限制性。
　　結(jié)果：
　?。?）22條重疊肽刺激25例活動(dòng)期BP患者PBMC后，21號(hào)肽段致使8例患者（占全部患者的32％）、18號(hào)肽段致使9例患者（占全部患者的36%）、14號(hào)肽段和13號(hào)肽段均致使10例患者（

8、占全部患者的40%）分泌較多的細(xì)胞因子IFN-γ，產(chǎn)生較為強(qiáng)烈的Th1細(xì)胞應(yīng)答。說明BPAG2-NC16A重疊肽中的21號(hào)肽段492-506aa：VRKLKARVDELERIR、18號(hào)肽段501-515aa：ELERIRRSILPYGDS、14號(hào)肽段513-527aa：GDSMDRIEKDRLQGM和13號(hào)肽段516-530aa：MDRIEKDRLQGMAPA為潛在的BP特異性Th1細(xì)胞表位。
　?。?）22條重疊肽刺激26例活動(dòng)

9、期BP患者PBMC后，21號(hào)肽段致使15例患者（占全部患者的57.7%）、20號(hào)肽段致使9例患者（占全部患者的34.6%）、18號(hào)肽段和14號(hào)肽段均致使7例患者（占全部患者的26.9%）分泌較多的細(xì)胞因子IL-4，產(chǎn)生較為強(qiáng)烈的Th2細(xì)胞應(yīng)答。說明BPAG2-NC16A重疊肽中的21號(hào)肽段492-506aa：VRKLKARVDELERIR、20號(hào)肽段495-509aa：LKARVDELERIRRSI、18號(hào)肽段501-515aa：ELE

10、RIRRSILPYGDS和14號(hào)肽段513-527aa：GDSMDRIEKDRLQGM為潛在的BP特異性Th2細(xì)胞表位。
　?。?）22條重疊肽刺激IFN-γ分泌的Th1細(xì)胞表位應(yīng)答寬度和刺激IL-4分泌的Th2細(xì)胞表位應(yīng)答寬度與患者抗BPAG2-NC16A抗體滴度均不相關(guān)。
　?。?）以上篩選獲得的Th2表位陽性患者，其PBMC經(jīng)21號(hào)肽段、20號(hào)肽段和14號(hào)肽段刺激后，分泌IL-4的水平明顯升高并與患者抗BPAG2-NC

11、16A抗體滴度呈正相關(guān)。
　?。?）篩選出的陽性肽段21號(hào)、18號(hào)和14號(hào)，刺激BP患者PBMC后，CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖，與陰性對(duì)照及空白對(duì)照相比具有差異。
　?。?）篩選出的陽性肽段21號(hào)、18號(hào)和14號(hào)，刺激BP患者PBMC后，與健康對(duì)照組相比，BP患者組B細(xì)胞活化水平升高。
　?。?）篩選出的陽性肽段21號(hào)、18號(hào)和14號(hào)，刺激BP患者PBMC后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中可檢測(cè)出抗BPAG2-NC16A抗體。

12、r>　　（8）采用相同的方法對(duì)BP患者不同時(shí)期的Th2表位進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)患者疾病穩(wěn)定期陽性肽段數(shù)均少于活動(dòng)期陽性肽段數(shù)，但疾病穩(wěn)定期與疾病活動(dòng)期陽性肽段并不完全一致，部分患者有新的表位出現(xiàn)，說明存在表位擴(kuò)展現(xiàn)象。
　?。?）對(duì)T細(xì)胞表位進(jìn)行HLA限制性分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)先加入HLA-ABC和HLA-DR中和抗體可使陽性肽段刺激 BP患者 PBMC后 IL-4分泌明顯減少，而預(yù)先加入HLA-DP中和抗體和HLA-DQ中和抗體并不能減少刺激

13、后的IL-4分泌，說明篩選出的陽性肽段是屬于HLA-ABC和HLA-DR限制性的。
　　結(jié)論：
　　BP患者自身抗原BPAG2分子的NC16A區(qū)域具有明確的Th1細(xì)胞表位和Th2細(xì)胞表位。Th2細(xì)胞表位刺激細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度與BP患者血清自身抗體的滴度呈正相關(guān)。陽性表位刺激BP患者PBMC可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增殖、促進(jìn)B細(xì)胞的活化以及BP特異性抗體的產(chǎn)生。BP患者在不同的病期其Th2表位有所差異，存在表位擴(kuò)展現(xiàn)象。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)