人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體的構建、表達及純化.pdf

1、大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）是一種常見的慢性自身免疫性水皰性皮膚病，臨床表現為正常皮膚或紅斑基礎上的緊張性水皰、大皰，多見于老年人群，病情易反復發(fā)作。目前BP尚缺乏特異性治療手段而主要依靠應用糖皮質激素和免疫抑制劑等方法，雖然可以暫時起到緩解病情的作用，但需要長期應用產生的副作用以及BP病情的反復發(fā)作是臨床實際工作中最亟待解決的問題。
　　研究發(fā)現BP的發(fā)病是由致病性自身抗體介導、補體等多種炎癥成分

2、參與而最終導致皮膚免疫損傷的復雜過程。主要病理改變是表皮下水皰并伴有中性粒細胞、嗜酸性細胞等炎細胞浸潤。免疫學研究發(fā)現患者皮膚表皮真皮交界處的基底膜帶（basement membrane zone,BMZ）有抗體（IgG、IgE等）和補體沉積，同時在患者血清中可以檢測到特異性識別BMZ的自身抗體。
　　BP180系真表皮交界處基底膜帶半橋?？缒つz原蛋白，又稱ⅩⅦ型膠原（COL17）或大皰性類天皰瘡抗原2(BPAg2)，在維持表皮和

3、真皮的正常粘附方面起著至關重要的作用。目前證實BP180是BP致病性自身抗體所識別的主要靶抗原，其細胞外區(qū)域特別是第16非膠原編碼區(qū)（NC16A）是致病性自身抗體識別的主要靶表位區(qū)。
　　BP病理性自身抗體與自身抗原特異性結合并激活補體，肥大細胞脫顆粒，趨化中性粒細胞、嗜酸性細胞、單核細胞等炎細胞在局部浸潤并釋放中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)等蛋白水解酶和多種炎癥介質，造成明顯的免疫炎癥反應，導致在表

4、皮真皮黏附中起重要作用的分子結構和功能受損，真表皮分離最終發(fā)生表皮下水皰。一項較新的研究已經在人源化動物模型體內證實了BP患者抗BP180-NC16A自身抗體的致病作用，更深層次地闡明了BP的發(fā)病機理。在此復雜過程中，病理性自身抗體與自身抗原結合進而激活補體是至關重要的環(huán)節(jié)。因此，我們提出從這一關鍵環(huán)節(jié)入手，制備人源性基因工程小分子抗體，利用其能特異性識別靶抗原同時又不具有Fc段因而不能激活補體的特性，封閉與BP發(fā)病相關的自身抗原表位，

5、競爭性抑制自身抗體的結合，從而阻斷自身抗體的致病作用，探討更加有效和特異的治療策略。
　　本課題組在前期工作中，直接以大皰性類天皰瘡患者的外周血淋巴細胞為基因來源，利用噬菌體抗體庫技術篩選首次得到針對大皰性類天皰瘡抗原BP180-NC16A的人源性基因工程抗體Fab片段P10。本研究在此基礎上構建scFv，為BP的基因工程抗體治療提供新的候選抗體。
　　目的：利用基因重組技術制備人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180的單鏈抗體

6、（scFv），進行大量原核表達，獲得純化目的蛋白，并對其免疫學特性進行鑒定。為進一步研究BP的發(fā)病機制和靶向治療奠定基礎。
　　方法：經PCR分別擴增抗BP180人源性Fab抗體P10輕鏈可變區(qū)（Vλ）和重鏈可變區(qū)（VH）基因，應用重疊延伸拼接法(SOE)通過連接肽Linker在體外直接完成輕重鏈可變區(qū)的組合形成scFv。所獲得的scFv基因片段再與pGEM-T載體連接，經藍白斑篩選，菌落PCR快速鑒定陽性克隆，進行SacⅠ和Sp

7、eⅠ雙酶切鑒定后回收純化目的產物。重組正確的scFv基因克隆入原核表達載體p3MH，電轉化大腸桿菌XL1-Blue，經輔助噬菌體VCSM13感染表達噬菌體抗體，ELISA檢測活性，雙酶切鑒定及DNA序列測定。選取活性最強的噬菌體抗體質粒酶切去除載體上的基因Ⅲ，載體自連，獲得人源性抗BP180-NC16A單鏈抗體的可溶性表達質粒。IPTG誘導進行scFv的大量可溶性表達，上清用50％飽和硫酸銨鹽析沉淀，充分透析后利用親和層析法分離純化目的

8、蛋白，SDS-PAGE鑒定純度。ELISA和Western blot鑒定活性和特異性，以人皮膚冰凍切片為底物進行間接免疫熒光檢測結合部位。
　　結果：成功構建人源性抗BP180-NC16A單鏈抗體的表達質粒，雙酶切和DNA測序完全正確，命名為pscFv10。噬菌體單鏈抗體經ELISA檢測結合活性良好。載體自連后轉化大腸桿菌，表達產物經SDS-PAGE鑒定可溶性目的蛋白的純度在89％以上。ELISA和Western blot方法證實

9、所獲的單鏈抗體具備良好抗原結合活性和高度特異性。間接免疫熒光檢測，在人皮膚的表皮真皮交界處形成線狀熒光條帶，表明該抗體特異性識別人皮膚基底膜帶的BP180分子。
　　結論：采用基因重組技術成功構建了人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180-NC16A的單鏈抗體，并獲得了可溶性表達。通過原核表達及親和層析法有效純化目的蛋白，并進行體外生物學鑒定，證明所獲單鏈抗體具備良好的抗原結合活性和特異性，為下一步靶向BP180分子免疫學發(fā)病機理的研