人源性抗大皰性類(lèi)天皰瘡抗原BP180單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)及純化.pdf

1、大皰性類(lèi)天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）是一種常見(jiàn)的慢性自身免疫性水皰性皮膚病，臨床表現(xiàn)為正常皮膚或紅斑基礎(chǔ)上的緊張性水皰、大皰，多見(jiàn)于老年人群，病情易反復(fù)發(fā)作。目前BP尚缺乏特異性治療手段而主要依靠應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等方法，雖然可以暫時(shí)起到緩解病情的作用，但需要長(zhǎng)期應(yīng)用產(chǎn)生的副作用以及BP病情的反復(fù)發(fā)作是臨床實(shí)際工作中最亟待解決的問(wèn)題。
　　研究發(fā)現(xiàn)BP的發(fā)病是由致病性自身抗體介導(dǎo)、補(bǔ)體等多種炎癥成分

2、參與而最終導(dǎo)致皮膚免疫損傷的復(fù)雜過(guò)程。主要病理改變是表皮下水皰并伴有中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)患者皮膚表皮真皮交界處的基底膜帶（basement membrane zone,BMZ）有抗體（IgG、IgE等）和補(bǔ)體沉積，同時(shí)在患者血清中可以檢測(cè)到特異性識(shí)別BMZ的自身抗體。
　　BP180系真表皮交界處基底膜帶半橋粒跨膜膠原蛋白，又稱(chēng)ⅩⅦ型膠原（COL17）或大皰性類(lèi)天皰瘡抗原2(BPAg2)，在維持表皮和

3、真皮的正常粘附方面起著至關(guān)重要的作用。目前證實(shí)BP180是BP致病性自身抗體所識(shí)別的主要靶抗原，其細(xì)胞外區(qū)域特別是第16非膠原編碼區(qū)（NC16A）是致病性自身抗體識(shí)別的主要靶表位區(qū)。
　　BP病理性自身抗體與自身抗原特異性結(jié)合并激活補(bǔ)體，肥大細(xì)胞脫顆粒，趨化中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎細(xì)胞在局部浸潤(rùn)并釋放中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等蛋白水解酶和多種炎癥介質(zhì)，造成明顯的免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致在表

4、皮真皮黏附中起重要作用的分子結(jié)構(gòu)和功能受損，真表皮分離最終發(fā)生表皮下水皰。一項(xiàng)較新的研究已經(jīng)在人源化動(dòng)物模型體內(nèi)證實(shí)了BP患者抗BP180-NC16A自身抗體的致病作用，更深層次地闡明了BP的發(fā)病機(jī)理。在此復(fù)雜過(guò)程中，病理性自身抗體與自身抗原結(jié)合進(jìn)而激活補(bǔ)體是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。因此，我們提出從這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，制備人源性基因工程小分子抗體，利用其能特異性識(shí)別靶抗原同時(shí)又不具有Fc段因而不能激活補(bǔ)體的特性，封閉與BP發(fā)病相關(guān)的自身抗原表位，

5、競(jìng)爭(zhēng)性抑制自身抗體的結(jié)合，從而阻斷自身抗體的致病作用，探討更加有效和特異的治療策略。
　　本課題組在前期工作中，直接以大皰性類(lèi)天皰瘡患者的外周血淋巴細(xì)胞為基因來(lái)源，利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選首次得到針對(duì)大皰性類(lèi)天皰瘡抗原BP180-NC16A的人源性基因工程抗體Fab片段P10。本研究在此基礎(chǔ)上構(gòu)建scFv，為BP的基因工程抗體治療提供新的候選抗體。
　　目的：利用基因重組技術(shù)制備人源性抗大皰性類(lèi)天皰瘡抗原BP180的單鏈抗體

6、（scFv），進(jìn)行大量原核表達(dá)，獲得純化目的蛋白，并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。為進(jìn)一步研究BP的發(fā)病機(jī)制和靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：經(jīng)PCR分別擴(kuò)增抗BP180人源性Fab抗體P10輕鏈可變區(qū)（Vλ）和重鏈可變區(qū)（VH）基因，應(yīng)用重疊延伸拼接法(SOE)通過(guò)連接肽Linker在體外直接完成輕重鏈可變區(qū)的組合形成scFv。所獲得的scFv基因片段再與pGEM-T載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，菌落PCR快速鑒定陽(yáng)性克隆，進(jìn)行SacⅠ和Sp

7、eⅠ雙酶切鑒定后回收純化目的產(chǎn)物。重組正確的scFv基因克隆入原核表達(dá)載體p3MH，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，經(jīng)輔助噬菌體VCSM13感染表達(dá)噬菌體抗體，ELISA檢測(cè)活性，雙酶切鑒定及DNA序列測(cè)定。選取活性最強(qiáng)的噬菌體抗體質(zhì)粒酶切去除載體上的基因Ⅲ，載體自連，獲得人源性抗BP180-NC16A單鏈抗體的可溶性表達(dá)質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行scFv的大量可溶性表達(dá)，上清用50％飽和硫酸銨鹽析沉淀，充分透析后利用親和層析法分離純化目的

8、蛋白，SDS-PAGE鑒定純度。ELISA和Western blot鑒定活性和特異性，以人皮膚冰凍切片為底物進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)合部位。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建人源性抗BP180-NC16A單鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒，雙酶切和DNA測(cè)序完全正確，命名為pscFv10。噬菌體單鏈抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)合活性良好。載體自連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定可溶性目的蛋白的純度在89％以上。ELISA和Western blot方法證實(shí)

9、所獲的單鏈抗體具備良好抗原結(jié)合活性和高度特異性。間接免疫熒光檢測(cè)，在人皮膚的表皮真皮交界處形成線狀熒光條帶，表明該抗體特異性識(shí)別人皮膚基底膜帶的BP180分子。
　　結(jié)論：采用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了人源性抗大皰性類(lèi)天皰瘡抗原BP180-NC16A的單鏈抗體，并獲得了可溶性表達(dá)。通過(guò)原核表達(dá)及親和層析法有效純化目的蛋白，并進(jìn)行體外生物學(xué)鑒定，證明所獲單鏈抗體具備良好的抗原結(jié)合活性和特異性，為下一步靶向BP180分子免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理的研