DVL-1與DVL-3在先天性巨結(jié)腸癥腸管中表達水平的研究.pdf

1、目的
　　先天性巨結(jié)腸癥（Hirschsprung'sDisease，HD）是小兒外科常見疾病之一，其發(fā)病率居先天性消化道畸形第二位，占存活嬰兒的1/5000～1/2000。其主要臨床表現(xiàn)為胎糞排出延遲，頑固性便秘和腹脹，常并發(fā)小腸結(jié)腸炎，低位性腸梗阻，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量甚至危及生命。HD的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前較為一致的觀點認(rèn)為患兒在胚胎期神經(jīng)發(fā)育過程中神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移發(fā)生障礙，腸神經(jīng)發(fā)育出現(xiàn)停頓，腸壁肌間神經(jīng)叢和粘

2、膜下神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失，以致受累腸段異常收縮，其近端結(jié)腸代償性擴張與肥厚，形成HD。
　　前期在國家自然科學(xué)基金課題(30772277)的資助下，利用雙向凝膠電泳(Two-eimensionalElectrophoresis，2-DE)技術(shù)，獲得了分辨率較高的HD狹窄段及正常段腸管組織蛋白表達圖譜，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行質(zhì)譜時間(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization-Time

3、ofFlightMassSpectrometry,MALDI-TOF-MS)技術(shù)，鑒定了39個差異蛋白質(zhì)點，得到21個陽性結(jié)果。其中蓬亂蛋白(Dishevelledprotein，DVL)與HD的發(fā)生關(guān)系密切。進而本研究選擇其中的亞型DVL-1與DVL-3進行研究。
　　DVL是機體組織細(xì)胞中廣泛存在的胞漿蛋白，屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，具有多功能和進化上高度保守的特點，于1959年由Fahmy等首次在果蠅可存活的Dishevelled(

4、Dsh)突變類型中克隆得到。之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)DVL廣泛存在于生物體中，從低等生物水螅、線蟲、爪蟾，到哺乳動物小鼠和人都存在DVL基因。目前在人類已鑒定出3個同源DVL亞基因，分別為DVL-1、DVL-2和DVL-3。研究發(fā)現(xiàn)，DVL在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞自我更新過程、調(diào)節(jié)胚胎生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生中都具有重要作用。近來，DVL在神經(jīng)系統(tǒng)及其胚胎發(fā)育相關(guān)疾病中的作用得到了研究者們越來越多的關(guān)注。目前有關(guān)DVL在HD中的表達研究國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道，

5、本研究的目的是測定DVL-1和DVL-3在HD中的表達情況，并探討其在HD發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　實驗方法
　　1、病例標(biāo)本
　　本研究經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，收集2006年4月至2012年3月經(jīng)鋇灌腸、直腸肛管側(cè)壓和術(shù)后病理切片證實的散發(fā)性HD狹窄段（無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段）和正常段（神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段）腸管組織標(biāo)本50例，男41例，女9例，年齡0.5～4.5歲，平均1.5歲。
　　2、實驗試劑

6、>　　DVL-1多克隆抗體（兔抗人，試劑編號:D3570，Sigma-Aldrich(R)Co.）;DVL-3多克隆抗體(兔抗人，試劑編號:3684R-100，BioVisionIncorporated);總RNA提取試劑盒（Promage公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscriptTMⅡRnaseHReverseTranscriptase、SYBRGreenⅠ的PCRMasterMix(TaKaRa);全蛋白提取試劑盒（北京碧云天生物技

7、術(shù)有限公司）;免疫組化染色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）;DAB試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。
　　3、實驗方法
　　利用免疫組織化學(xué)染色方法、熒光實時定量PCR(Quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)和蛋白印跡(WesternBlot)檢測50例HD患兒狹窄段（無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）和正常段（神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）腸管組織中DVL-1和DVL-3的表達情況，

8、并對其表達進行定量與比較分析。
　　結(jié)果
　　1、免疫組化實驗結(jié)果
　　DVL-1和DVL-3在HD狹窄段腸管的粘膜層細(xì)胞胞漿內(nèi)呈強陽性反應(yīng)，呈深棕黃色(++～+++)，而在HD正常段腸壁的粘膜層細(xì)胞胞漿內(nèi)呈陰性或弱陽性反應(yīng)，無色或淡黃色（-～±）。狹窄段腸管中異常增生的神經(jīng)纖維組織可被DVL-3染成深黃色，而正常段的神經(jīng)叢不被DVL-3著色。通過半定量形態(tài)測定分析，DVL-1和DVL-3平均陽性表達面積百分率在狹窄段

9、分別為0.2659±0.0065和0.2551±0.0103，正常段分別為0.0461±0.0067和0.0381±0.0082，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、qRT-PCR實驗結(jié)果
　　qRT-PCR發(fā)現(xiàn)DVL-1在HD狹窄段的相對表達量是正常段的2.06倍，DVL-3在HD狹窄段的相對表達量是正常段的3.12倍。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、WesternBlot實驗結(jié)果
　　We

10、sternBlot結(jié)果顯示，DVL-1在HD狹窄段腸管中蛋白相對含量39.71±4.53，在正常段腸管中蛋白相對含量為15.01±2.66，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DVL-3在HD狹窄段腸管中蛋白相對含量為53.90±6.79;在正常段腸管中蛋白相對含量為20.13±3.63，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　DVL-1和DVL-3mRNA與蛋白在HD狹窄段腸管中的表達明顯高于正常段腸管中的表達，提