肉毒毒素中和抗體的制備以及快速檢驗(yàn)診斷方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、肉毒毒素（botulinum neurotoxins，BoNTs）由肉毒桿菌產(chǎn)生，是典型的A-B型神經(jīng)外毒素，通過抑制神經(jīng)肌肉接頭處乙酰膽堿囊泡釋放，阻斷神經(jīng)肌肉接頭處的沖動(dòng)傳導(dǎo)，引起肌肉麻痹而致病。BoNTs是目前已知毒性最強(qiáng)的毒素（小于1μg即可以殺死一個(gè)成年人）。至今已發(fā)現(xiàn)有7種（A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型）血清型的BoNTs，引起人類中毒的主要是A型、B型、E型和F型。BoNTs制備、運(yùn)輸及釋放相對(duì)其他毒素容易，因

2、此美國(guó)疾病控制中心將其列為A類的生物威脅，其中以A型軍事意義最大，但是其他型別也不可忽視，若為稀有型別的毒素中毒流行則更應(yīng)該懷疑可能是人為釋放。
　　BoNTs是聯(lián)合國(guó)《禁止生物武器公約》明確的重要生物戰(zhàn)劑。毒性大，性質(zhì)穩(wěn)定。另外易于制備，易被恐怖分子獲得，能夠以氣溶膠的形式散布，食物和水源易受其污染，是被用來作為生物戰(zhàn)劑的主要毒素之一。因此，能檢測(cè)到低劑量肉毒毒素的高靈敏度的方法對(duì)反生物武器戰(zhàn)爭(zhēng)和反恐怖襲擊具有重要的軍事意義。<

3、br>　　肉毒毒素（結(jié)晶純毒素）分泌時(shí)為相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）150，000的單鏈蛋白，被酶切為二硫鍵鏈接的雙鏈之后被活化，其中重鏈Mr100,000，輕鏈Mr50,000。重鏈C端（C-terminal of heavy chain, HCC，Mr50,000）可以結(jié)合神經(jīng)肌肉接頭突觸前膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂和膜蛋白，介導(dǎo)毒素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。毒素進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)后，在鋅離子存在的情況下，輕鏈可以水解SNARE蛋白，其中A、C和E型肉毒毒素水解SNA

4、P25，而B、D、F和G型肉毒毒素水解VAMP2，從而抑制乙酰膽堿囊泡的釋放，引起神經(jīng)肌肉接頭處的沖動(dòng)傳導(dǎo)障礙，肌肉麻痹。
　　近年來發(fā)現(xiàn)肉毒毒素具有較廣闊的藥用前景。A型肉毒毒素現(xiàn)已應(yīng)用于痙攣性斜頸、面肌痙攣、局部肌肉痙攣、眼瞼痙攣、多汗癥以及眼科和耳鼻喉科疾病等的治療。在美容方面，局部注射肉毒毒素可以減少皺紋的產(chǎn)生，最近發(fā)現(xiàn)其還可用于治療慢性疼痛。其治療的適應(yīng)癥仍在不斷的拓展中，應(yīng)對(duì)其濫用以及錯(cuò)用保持警惕，2006年美國(guó)曾報(bào)道

5、了4例病人因注射未經(jīng)注冊(cè)的肉毒毒素制劑而導(dǎo)致的中毒。
　　目前沒有特異的治療藥物可以預(yù)防或治療肉毒毒素中毒，唯一有效的方法是及時(shí)注射相應(yīng)型別的肉毒毒素抗血清或者抗體，可以減少神經(jīng)損傷程度。由于其各型別型毒素之間交叉反應(yīng)少，治療需要相對(duì)特異的抗毒素血清，因此及時(shí)診斷并分型對(duì)治療肉毒毒素中毒非常重要，快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法對(duì)肉毒毒素中毒防控意義重大。傳統(tǒng)的小鼠生物學(xué)活性試驗(yàn)檢測(cè)肉毒毒素存在諸多缺點(diǎn)，如實(shí)驗(yàn)所需要時(shí)間較長(zhǎng)，影響因素多

6、，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高，而且存在一定的假陽性率和假陰性率。國(guó)外多年來開發(fā)了多種實(shí)驗(yàn)室診斷方法，其中免疫學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及其改進(jìn)方法應(yīng)用最為廣泛，其不僅可以檢測(cè)有活性的毒素，并且對(duì)毒素分解產(chǎn)物或者失活毒素仍可檢測(cè)，已被美國(guó)疾病控制中心采用的檢測(cè)方法。另外，利用人工合成的毒素酶解底物片段，建立了肽鏈內(nèi)切酶免疫檢測(cè)方法，可達(dá)極高的檢測(cè)靈敏度，但是有時(shí)可出現(xiàn)

7、假陰性結(jié)果。
　　預(yù)先免疫類毒素或者重組疫苗可以用于保護(hù)肉毒毒素中毒，但是鑒于自然發(fā)生的肉毒毒素中毒十分罕見，群體免疫或者部隊(duì)集體免疫肉毒毒素是不合適的。肉毒毒素中毒后癥狀進(jìn)展迅速，中毒后免疫意義不大。預(yù)防和治療肉毒毒素中毒最有效的辦法是中毒前或中毒后早期注射中和抗體或者抗血清。已經(jīng)在臨床使用的包括馬血清和人血清，分別用于成人和兒童中毒。但是馬血清或者人血清來源和產(chǎn)量均受到很多限制，我國(guó)僅在蘭州生物制品所和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院貯備有馬抗

8、血清。單克隆抗體具有高特異性、高重復(fù)性、成分確定和易于規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)，來源不受限制，可以進(jìn)一步人源化，因此開發(fā)治療性單克隆抗體是較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的途徑。目前報(bào)道的單株單克隆抗體中和能力可中和10-100LD50的肉毒毒素，2株或更多株組合使用時(shí)可以極大地提高單克隆抗體的中和能力，為進(jìn)一步生產(chǎn)治療肉毒毒素中的制劑提供了可能。美國(guó)已報(bào)道3株識(shí)別A型肉毒毒素的中和性單克隆抗體的組合作為治療性藥物正在被美國(guó)FDA審查。
　　通過免疫肉毒毒素

9、重鏈羧基端片段rHc和B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，我們獲得了制備了56株針對(duì)A型肉毒毒素和40株針對(duì)F型的鼠源性單克隆抗體，分別命名為FMU-BTA1～56和FMU-BTF1～40。通過小鼠中和活性實(shí)驗(yàn)，確定56株抗 A型肉毒毒素的mAb混合后，每50μL抗體最高可中和2×104LD50的A型肉毒毒素，40株抗F型肉毒毒素的mAb混合后未滴定最高保護(hù)能力，但是也可中和超過100LD50的F型肉毒毒素（蘭州生物制品所第五研究室提供）。其中FMU-B

10、TA49單株可中和超過50LD50的A型肉毒毒素。3株具有中和活性的抗A型肉毒毒素mAb混合之后，每100μg最高可中和500LD50的毒素。
　　基于FMU-BTA和FMU-BTF系列單克隆抗體，分別開發(fā)了檢測(cè)A型肉毒毒素的雙單克隆抗體夾心 ELISA以及酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光（Chemiluminescent immunoassay， CLEIA）試劑盒和檢測(cè)F型肉毒毒素雙單克隆抗體夾心ELISA試劑盒，其檢測(cè)靈敏度都達(dá)到了小鼠活性