一種方便易用的A型肉毒毒素活性檢測(cè)方法的建立.pdf

1、肉毒毒素（BoNT）是由肉毒梭菌在厭氧的情況下，產(chǎn)生的神經(jīng)外毒素，依據(jù)毒素抗原性的不同，分A～G七個(gè)亞型，其中以A型的毒性最強(qiáng)，是生物毒素和化學(xué)毒物中毒性最強(qiáng)的物質(zhì)，引起的臨床癥狀也遠(yuǎn)遠(yuǎn)重于B型和E型。A型肉毒毒素現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于眼瞼痙攣、面肌痙攣、腦癱、整容除皺、瘦腿瘦臉等神經(jīng)肌肉阻滯功能的治療，多汗癥、胃失弛緩癥等自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的治療以及偏頭痛、慢性疼痛等感覺(jué)神經(jīng)功能的治療。
　　隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的飛速發(fā)展，人們對(duì)美容的需

2、求也越來(lái)越多。最近幾年，使用肉毒毒素美容除皺、瘦腿瘦臉的愛(ài)美女士也越來(lái)越多。目前用于市場(chǎng)上的品牌有國(guó)外的Botox（保妥適，美國(guó)Allergen公司）、Dysport（英國(guó)Ipsen公司）、Myobloc（美國(guó) Elan公司）以及國(guó)內(nèi)BTXA（中國(guó)衡力）等。在我國(guó)，批準(zhǔn)上市的用于肉毒毒素治療疾病及美容目的的，只有美國(guó)的Botox（保妥適）和中國(guó)蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的衡力。Botox的治療作用有頸部肌張力障礙、嚴(yán)重的原發(fā)性腋

3、窩多汗癥、神經(jīng)源性逼尿肌過(guò)度活動(dòng)、膀胱過(guò)度活動(dòng)癥、斜視、瞼痙攣、慢性偏頭痛、上肢痙攣。BTXA的治療作用有眼瞼痙攣、面肌痙攣的成人患者；急性麻痹性、內(nèi)分泌肌病所引起的斜視和無(wú)法手術(shù)治療12歲以上患者的斜視；暫時(shí)性改善65歲以下的眉間紋。但在這類(lèi)肉毒毒素制品的使用過(guò)程中，也出現(xiàn)了一些中毒的案例，主要由注射劑量過(guò)大、注射部位藥物不適當(dāng)?shù)膹浬⒆饔靡?，不同程度的出現(xiàn)了眼瞼痙攣、視物模糊、上瞼下垂、飲水嗆咳、吞咽困難、構(gòu)音障礙、發(fā)聲困難、肌力減

4、退甚至呼吸困難等癥狀。
　　當(dāng)肉毒毒素作為一種商業(yè)用的生物制劑，對(duì)其活性的研究尤為重要。生物制品普遍采用質(zhì)量和活性兩種表示方法，即單位質(zhì)量的生物制品中所含有的生物學(xué)活性，反映活性組成比具體情況。本研究目的是研制一種方便易用的膠體金試紙條，基于金屬鋅的酶切反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及免疫反應(yīng)原理來(lái)檢測(cè)肉毒毒素的活性。檢測(cè)的原理為BoNT/A摻雜的血清樣品和特別設(shè)計(jì)的底物肽在孵育一段時(shí)間后，可將特異性底物肽酶切從而使氨基端的生物素與羧基端的組氨酸標(biāo)簽

5、分離，使得標(biāo)記膠體金顆粒的鏈霉親和素-底物肽復(fù)合物不能被層析試紙條的檢測(cè)線上包被的抗組氨酸標(biāo)簽抗體捕獲，從而呈現(xiàn)出一個(gè)不同于BoNT/A陰性血清的結(jié)果。
　　首先我們進(jìn)行了 A、B型肉毒梭菌的人工培養(yǎng)。將 A型肉毒梭菌菌種接至TPYG液體培養(yǎng)基，進(jìn)行肉毒梭菌的人工增菌培養(yǎng)。在37℃的厭氧溫箱中培養(yǎng)48 h后，將獲得的新鮮培養(yǎng)液接種至1 L的TPOM培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)毒培養(yǎng)。用硫酸溶液沉淀抽提，得到粗毒。然后用硫酸銨沉淀，去除核酸。最后用

6、凝膠柱和離子交換柱進(jìn)行精制純化。對(duì)純化的肉毒毒素進(jìn)行蛋白定量后用小鼠毒力試驗(yàn)來(lái)測(cè)定毒素的生物學(xué)活性。B型肉毒梭菌的培養(yǎng)、肉毒毒素純化、定量及生物學(xué)活性鑒定同A型肉毒毒素，但沒(méi)有精制步驟。由此而得到的A、B型肉毒毒素用于摻雜模擬臨床血清樣本。
　　然后設(shè)計(jì) A型肉毒毒素底物序列如下： N端生物素化-TRIDEANQRATKM-6×His-Tag。該底物肽包含三個(gè)部分：N端生物素標(biāo)簽、A型肉毒毒素特異性底物肽序列和組氨酸標(biāo)簽。其中Q-

7、R為BoNT/A特異性切割的位點(diǎn)。當(dāng)BoNT/A對(duì)肽段發(fā)生作用時(shí)，作為肽鏈內(nèi)切酶，會(huì)引起肽鏈斷裂，從而產(chǎn)生含有不同生物標(biāo)簽的肽段，從而在膠體金試紙條上呈現(xiàn)不同的顯色模式。將抗His標(biāo)簽單克隆抗體、抗鏈霉親和素單克隆抗體分別作為T(mén)線和C線，膠體金包被的鏈霉親和素作為探針按常規(guī)的制備方法制成層析試紙條后，我們對(duì)T線濃度、底物肽最小劑量、毒素和底物肽在體外孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果， T線濃度為1 mg/mL；特異性底物肽的優(yōu)化劑量為1

8、 ng/μL；毒素和底物肽的體外孵育時(shí)間為12 h。此外，我們用空白對(duì)照血清、B型肉毒毒素?fù)诫s的模擬血清和不同稀釋度的A型肉毒毒素?fù)诫s的模擬血清對(duì)試紙條的特異性及靈敏性進(jìn)行了評(píng)估。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，膠體金層析試紙條的最低檢測(cè)限可達(dá)到1.3 LD50/mL，約為20 pg/mL，靈敏度與金標(biāo)準(zhǔn)的小鼠致死實(shí)驗(yàn)相當(dāng)，但檢測(cè)時(shí)間從4天減少到12 h。
　　本研究建立的方法樣本和試劑消耗量少，檢測(cè)流程短，操作簡(jiǎn)便易行，更適于在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和資

9、源有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)使用。通過(guò)檢測(cè)活性肽酶的含量并優(yōu)化酶聯(lián)信號(hào)放大的反應(yīng)條件，使針對(duì)有活性的A型肉毒毒素的檢測(cè)較之前實(shí)驗(yàn)室使用的方法更加精確。在我國(guó)，肉毒中毒事件常集中發(fā)生在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，交通的不便與專(zhuān)業(yè)設(shè)備的欠缺給肉毒中毒的診斷和救治帶來(lái)很大的困難。該檢測(cè)方法的建立可以有力的緩解上述地區(qū)感染肉毒中毒后的誤診及漏診，提高診治率。而且通過(guò)設(shè)計(jì)毒素特異性的底物肽的思路，該方案也可擴(kuò)展用于其余血清型肉毒毒素的檢測(cè)。此外，A型肉毒毒素目前被一些國(guó)