肺動(dòng)脈高壓細(xì)胞治療研究中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞性別對(duì)療效的影響及其機(jī)制.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(PAH)是一種嚴(yán)重且致命的疾病。其特點(diǎn)是肺動(dòng)脈壓升高和肺的病理改變,如內(nèi)皮損傷,肺血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移所導(dǎo)致的肺血管腔減小,以及最終伴發(fā)的右心室肥厚和終末期心臟衰竭。但是肺動(dòng)脈高壓至今缺乏高效特異性的治療方法,盡管常規(guī)療法有顯著進(jìn)步,預(yù)后卻仍然不理想。近年來(lái)干細(xì)胞被成功應(yīng)用于多種疾病的治療。由于它所具有的,相比一般藥物治療更高的安全有效性,干細(xì)胞治療已成為疾病治療策略的研究熱點(diǎn),并被運(yùn)用于對(duì)肺動(dòng)脈高壓的治療研究中。

2、>　　最近在脂肪分化、關(guān)節(jié)損傷等疾病模型中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療的療效存在性別差異。而對(duì)于干細(xì)胞治療肺動(dòng)脈高壓效果的性別差異和其潛在的機(jī)制卻未有研究。本研究在探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)治療肺動(dòng)脈高壓性別差異的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)雌性BMSCs無(wú)論以性別匹配或不匹配方式治療野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈高壓均比雄性BMSCs有更好的治療效果,表現(xiàn)為右心室肥厚和肺阻力血管肌化程度有更大幅度的降低。體外實(shí)驗(yàn)中在炎癥、氧化應(yīng)激狀態(tài)下,BMSCs的[

3、Ca2+]i動(dòng)力學(xué)、增殖和遷移能力均有顯著的性別差異。
　　出乎意料的是,我們發(fā)現(xiàn)雌性BMSCs的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白水平比雄性BMSCs高得多。GAPDH最近已被證明是一種多功能蛋白質(zhì),具有不同的功能。我們通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)敲除雌性BMSCs的GAPDH或在雄性BMSCs過(guò)表達(dá)GAPDH,均能逆轉(zhuǎn)上述細(xì)胞生物學(xué)行為和治療效果的差異。綜上,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GAPDH在雌性BMSCs通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i

4、信號(hào)及相關(guān)的細(xì)胞行為,從而在治療肺動(dòng)脈高壓過(guò)程中發(fā)揮比雄性BMSCs更加優(yōu)越的治療作用。
　　目的:
　　干細(xì)胞引入體內(nèi)后,為特異性示蹤其定位與變化,現(xiàn)多采用將雄性干細(xì)胞引入雌性動(dòng)物體內(nèi),藉由Y染色體來(lái)特異示蹤,因此不可避免地忽視了干細(xì)胞性別差異對(duì)治療效果的影響。本實(shí)驗(yàn)利用分離自同胎生雌性和雄性小鼠的不同性別骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),觀察干細(xì)胞性別差異對(duì)肺動(dòng)脈高壓治療效果的影響。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)采用

5、8周齡體重在22g左右的C57小鼠,尾靜脈注射60mg/kg的野百合堿MCT誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型,在MCT注射三天后分組靜脈給予2×106個(gè)不同性別BMSCs治療,28天后以右心肥厚指數(shù)RV/(LV+S)(右心室/(左心室+間隔))和肺組織病理切片所顯示的肺血管肌化程度(muscularization)為指標(biāo),評(píng)估治療效果。
　　結(jié)果:
　　(1)光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)單個(gè)BMSC呈梭形多角形,細(xì)胞融合后呈鋪路石樣;流式鑒定細(xì)胞表面

6、標(biāo)志:CD29-PE+(99.96％±0.03%);CD34-PE-(0.34%±0.13%);CD45-APC-Cy7(1.97%±0.38%)。
　　(2)在對(duì)MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓治療中,雌性小鼠右心肥厚指數(shù)造模后明顯增加(0.278±0.009vs0.357±0.019,p<0.05),雌性BMSCs降低右心肥厚指數(shù)的作用表現(xiàn)出明顯優(yōu)于雄性BMSCs的作用(0.275±0.026vs0.311±0.022,p<0.05);

7、且在雄性小鼠,雌性BMSCs也同樣表現(xiàn)出明顯優(yōu)于雄性BMSCs的作用(0.2835±0.028vs0.326±0.045,p<0.05)。
　　(3)在對(duì)MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓治療中,雌性小鼠肺動(dòng)脈肌化(muscularization)造模后明顯增加(38.3%±2.9%vs82.3%±7.8%,p<0.05),但是雌性BMSCs降低肺動(dòng)脈肌化的作用明顯優(yōu)于雄性BMSCs的作用(41.7%±5.8%vs55.3%±5.0%,p<0

8、.05);且在雄性小鼠,雌性BMSCs也同樣表現(xiàn)出明顯優(yōu)于雄性BMSCs的作用(40.0%±4.8%vs54.0%±6.9%,p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　在MCT誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈高壓模型中,雌、雄BMSCs均可以有效減緩模型小鼠右心室肥厚和肺動(dòng)脈肌化程度,從而起到有效治療肺動(dòng)脈高壓的作用,而雌性BMSCs則表現(xiàn)出更優(yōu)于雄性BMSCs的治療效果。
　　目的:
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在被引入發(fā)生肺動(dòng)

9、脈高壓的人和動(dòng)物體內(nèi)后必然置身于不同的病理內(nèi)環(huán)境,比較常見(jiàn)的包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等等。BMSCs要發(fā)揮其修復(fù)內(nèi)皮和治療肺動(dòng)脈高壓的作用,必須能夠適應(yīng)這些微環(huán)境。觀察并比較在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)時(shí)雌、雄BMSCs生物學(xué)行為包括鈣信號(hào)、增殖和遷移能力、connexin43表達(dá)等方面的差異,以期闡明BMSCs在肺動(dòng)脈高壓治療中表現(xiàn)出來(lái)的性別差異的機(jī)制。
　　方法:
　　用不同濃度(1μmol/L、10μmol/L、100μmol/

10、L)的組胺和不同濃度(100μmol/L、250μmol/L、500μmol/L)過(guò)氧化氫(H2O2)刺激BMSCs,同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光離子成像系統(tǒng)檢測(cè)[Ca2+]i變化,確定能夠使BMSCs表現(xiàn)出明顯不同的鈣信號(hào)差異的組胺和H2O2的濃度。用確定濃度后的組胺和H2O2刺激BMSCs,用MTS檢測(cè)BMSCs增殖,用transwell小室檢測(cè)遷移能力的差異,用westernblot方法觀察和比較雌、雄BMSCs中connexin43和GAPD

11、H的蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　(1)組胺誘導(dǎo)雌、雄BMSCs的鈣反應(yīng):1μΜ組胺刺激雌性BMSCs(F-BMSCs)約78%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣振蕩,雄性BMSCs(M-BMSCs)71.4%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高;10μΜ組胺刺激F-BMSCs約78%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣振蕩,74%M-BMSCs呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高;100μΜ組胺刺激F-BMSCs約61%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,67.4%M-

12、BMSCs呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高。
　　(2)H2O2誘導(dǎo)雌、雄BMSCs的鈣反應(yīng):100μΜH2O2刺激雌性BMSCs(F-BMSCs)約81%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣振蕩,雄性BMSCs(M-BMSCs)79.5%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高;250μΜH2O2刺激F-BMSCs約73.3%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣振蕩,75%M-BMSCs呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高;500μΜH2O2刺激F-BMSCs約73%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的

13、鈣振蕩,79%M-BMSCs呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高。
　　(3)從雌、雄BMSCs增殖曲線可以看出,雌性BMSCs相比于雄性BMSCs增殖更快;在細(xì)胞生長(zhǎng)滯后階段用10μM組胺和100μMH2O2刺激后細(xì)胞的增殖,雌、雄BMSCs在沒(méi)有刺激時(shí)增殖沒(méi)有明顯差異,但10μM組胺刺激后雌性BMSCs增殖加快,而雄性BMSCs增殖無(wú)明顯改變(1.42±0.08vs1.01±0.05,p<0.05),100μMH2O2刺激后雌性BM

14、SCs增殖也加快,而雄性BMSCs增殖無(wú)明顯改變(1.34±0.11vs0.94±0.06,p<0.05)。
　　(4)用10μM組胺和100μMH2O2刺激后細(xì)胞的遷移,雌性BMSCs沒(méi)有刺激時(shí)遷移每個(gè)視野細(xì)胞個(gè)數(shù)比雄性BMSCs多(32.6±5.8vs29.8±4.9,p<0.05),10μM組胺刺激后雌性BMSCs遷移細(xì)胞增加而雄性BMSCs無(wú)明顯改變(40.8±7.7vs30.4±4.0,p<0.05);100μMH2O2

15、刺激后雌性BMSCs遷移細(xì)胞增加而雄性BMSCs無(wú)明顯改變(42.3±8.4vs32.4±5.4,p<0.05)。
　　(5)組胺和H2O2刺激后BMSCs的Connexin43表達(dá):雌、雄BMSCs在沒(méi)有刺激時(shí)Connexin43的磷酸化和非磷酸化表達(dá)沒(méi)有明顯差異,組胺刺激后雌性BMSCs磷酸化Connexin43(pCx43)增加而雄性BMSCs減少(1.83±0.44vs0.57±0.14,p<0.05),雌性BMSCs非磷

16、酸化Cx43(dpCx43)減少而雄性BMSCs增加(0.66±0.33vs1.46±0.19,p<0.05);H2O2刺激后雌性BMSCs磷酸化Connexin43(pCx43)增加而雄性BMSCs減少(1.65±0.27vs0.60±0.03,p<0.05),雌性BMSCs非磷酸化Cx43(dpCx43)而雄性BMSCs增加(0.89±0.19vs1.31±0.14,p<0.05)。
　　(6)組胺和H2O2刺激后BMSCs的

17、GAPDH表達(dá):在無(wú)任何刺激時(shí),雄性BMSCs的GAPDH基礎(chǔ)水平只有于雌性BMSCs的0.626±0.07倍(p<0.05);雌性BMSCs在組胺刺激后GAPDH表達(dá)增加1.38±0.15倍(p<0.05),在H2O2刺激后增加1.36±0.17倍(p<0.05);而雄性BMSCs則在上述刺激后均沒(méi)有發(fā)生明顯的GAPDH表達(dá)水平變化(vsM-BMSCsblankcontrol,p>0.05)。
　　結(jié)論:
　　在用H2O2

18、和/或組胺模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥狀態(tài)等刺激的體外試驗(yàn)中,不同性別BMSCs在細(xì)胞增殖、遷移和[Ca2+]i的動(dòng)力學(xué)等方面均具有顯著性差異。出乎意料的是,與雄性BMSCs相比,雌性BMSCs具有更高的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)蛋白表達(dá)水平。GAPDH最近已被證明是一種多功能蛋白質(zhì),具有不同的功能。我們提出GAPDH可能是BMSCs存在性別差異的關(guān)鍵因素。
　　目的:
　　為了探討GAPDH在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC

19、s)對(duì)小鼠肺動(dòng)脈高壓治療中的關(guān)鍵作用,以及在體跟蹤BMSCs治療肺動(dòng)脈高壓可能的機(jī)制。
　　方法:
　　分離純化同胎生不同性別C57小鼠的BMSCs,利用GAPDH的過(guò)表達(dá)(overexpression-GAPDH)或干擾質(zhì)粒(siRNA-GAPDH)人為調(diào)控雌、雄BMSCs中GAPDH的表達(dá),通過(guò)對(duì)細(xì)胞在[Ca2+]i\動(dòng)力學(xué)、增殖和遷移能力等方面的檢測(cè),評(píng)估GAPDH的表達(dá)對(duì)BMSCs生物學(xué)行為的影響。在體實(shí)驗(yàn)利用MCT

20、誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓小鼠模型,雌雄模型小鼠分組給予人為干預(yù)GAPDH表達(dá)的雌、雄BMSCs治療,并利用質(zhì)粒本身所攜帶的GFP對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行示蹤,利用組織免疫熒光技術(shù)觀測(cè)BMSCs對(duì)血管內(nèi)皮的修復(fù)。
　　結(jié)果:
　　(1)westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs的GAPDH蛋白水平:干擾后雌性BMSCs的GAPDH的水平與雄性BMSCs的基礎(chǔ)水平?jīng)]有明顯差別,而過(guò)表達(dá)后的雄性BMSCs的GAPDH的水平明顯升高且與雌性BMSCs的

21、基礎(chǔ)水平?jīng)]有明顯差別。
　　(2)組胺和H2O2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后BMSCs的鈣反應(yīng):10μΜ組胺刺激雌性BMSCs空質(zhì)粒組(F-BMSCs+siRNAvector)約65%的胞呈現(xiàn)典型的鈣振蕩,雌性BMSCs干擾組(F-BMSCs+siRNA–GAPDH)約57%的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,雄性BMSCs空質(zhì)粒組(M-BMSCs+overexpressionvector)約68%的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,雄性BMS

22、Cs過(guò)表達(dá)組(M-BMSCs+overexpression-GAPDH)約64%的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣振蕩;100μΜH2O2刺激F-BMSCs+siRNAvector約64%的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鈣振蕩,約71%的F-BMSCs+siRNA-GAPDH呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,約79%的M-BMSCs+overexpressionvector呈現(xiàn)典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,約60%的M-BMSCs+overexpression-GAPDH

23、呈現(xiàn)典型的鈣振蕩。
　　(3)組胺和H2O2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后BMSCs的增殖和遷移:組胺和H2O2誘導(dǎo)干擾GAPDH的雌性BMSCs后增殖沒(méi)有明顯改變,而過(guò)表達(dá)GAPDH的雄性BMSCs則增殖加快(*p<0.05),有效地逆轉(zhuǎn)了雌、雄BMSCs增殖的差異;組胺和H2O2誘導(dǎo)干擾GAPDH的雌性BMSCs后遷移沒(méi)有明顯改變,而過(guò)表達(dá)GAPDH的雄性BMSCs則遷移加快(*p<0.05),有效地逆轉(zhuǎn)了雌、雄BMSCs遷移能力的差異。

24、　　(4)轉(zhuǎn)染后BMSCs治療小鼠肺動(dòng)脈高壓的療效:過(guò)表達(dá)GAPDH的雄性BMSCs對(duì)于緩解MCT誘導(dǎo)的鼠肺動(dòng)脈高壓模型右心室肥厚RV/(LV+S)優(yōu)于干擾GAPDH的雌性BMSCs(*p<0.05);過(guò)表達(dá)GAPDH的雄性BMSCs對(duì)于緩解MCT誘導(dǎo)的鼠肺動(dòng)脈高壓模型的肺血管肌化程度優(yōu)于干擾GAPDH的雌性BMSCs(*p<0.05)。
　　(5)在體觀察轉(zhuǎn)染后BMSCs治療小鼠肺動(dòng)脈高壓的療效:無(wú)論是雌性老鼠還是雄性老鼠,過(guò)表

25、達(dá)GAPDH的雄性BMSCs參與血管內(nèi)皮的修復(fù)占血管總數(shù)的比例明顯升高(*p<0.05),干擾GAPDH的雌性BMSCs參與血管內(nèi)皮的修復(fù)占血管總數(shù)的比例降低(*p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　GAPDH最近已被證明是一種多功能蛋白質(zhì),具有不同的功能。我們通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)人為調(diào)控GAPDH在雌性和/或雄性BMSCs中的表達(dá),有效逆轉(zhuǎn)了雌、雄BMSCs在生物學(xué)行為和對(duì)肺動(dòng)脈高壓治療效果上的差異。在體示蹤技術(shù)顯示我們植入的B