石斛酚、丁香酸的跨膜轉運初步研究.pdf

1、目的:
　　研究石斛酚、丁香酸的跨膜轉運分子機制，為新藥創(chuàng)制提供藥代動力學依據(jù)，為提高靶向細胞內藥物濃度和藥物靶向療效奠定堅實的理論基礎。
　　方法:
　　1.石斛酚、丁香酸的細胞靶向識別作用:以熒光標記的石斛酚和丁香酸為實驗材料，分別與人晶狀體上皮細胞(HLEC)、人正常肝細胞(L-02)、人臍靜脈血管內皮細胞(EA.hy926)、人肺癌細胞(A549)及人結腸癌細胞(SW480)孵育，比較各組細胞內的熒光強度，對熒

2、光強度進行定量分析，來間接反映兩種成分吸收進入細胞的量，進而判斷石斛酚和丁香酸是否具有細胞靶向性。
　　2.HLEC細胞內石斛酚、丁香酸吸收轉運量的濃度依賴性考察:運用激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)觀察HLEC細胞內石斛酚、丁香酸在不同作用濃度下細胞內的熒光分布及強度，探討兩種成分吸收轉運進入HLEC細胞的量與其濃度的相關性。
　　3.HLEC細胞內石斛酚、丁香酸吸收量的時間依賴性考察:運用LSCM觀察HLEC細胞內石斛酚

3、、丁香酸在不同時間段內細胞內的熒光強度，探討兩種成分吸收轉運進入HLEC細胞的量與孵育時間的相關性。
　　4.不同細胞轉運抑制劑及特定溫度對石斛酚、丁香酸吸收轉移進入HLEC細胞的影響:將HLEC細胞與含不同轉運抑制劑的培養(yǎng)基孵育2h后，用LSCM觀察，比較各組細胞中的熒光強度差異，計算來給你做成分的吸收抑制率。類似的，考察石斛酚、丁香酸吸收轉運進入HLEC細胞收溫度的影響情況。確定石斛酚、丁香酸的跨膜轉運作用方式。
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4、.用原子力顯微鏡檢測石斛酚、丁香酸跨膜運輸過程中，HLEC細胞膜表面粗糙度及超微結構的變化。
　　結果:
　　1.石斛酚吸收進入HLEC細胞內的量明顯大于EA.hy926細胞，只有少量進入L-02、A549和SW480細胞;丁香酸吸收進入HLEC細胞及L-02細胞內的量明顯大于SW480細胞及EA.hy926細胞，僅有少量藥物進入A549細胞。
　　2.石斛酚作用于HLEC細胞后，隨著濃度的增加細胞內的熒光強度也增強，

5、石斛酚濃度為1μg/ml時HLEC細胞內的吸收量較大，與其它各組相比**P＜0.01，石斛酚主要分布在細胞質中;當石斛酚濃度達到10μg/ml時，細胞中的熒光強度達到最大且分布在整個細胞范圍內。
　　丁香酸作用于細胞后，隨著濃度的增加細胞中的熒光強度也增強，當丁香酸濃度小于10μg/ml時，細胞內的熒光強度均較弱;當丁香酸濃度大于或等于10μg/ml時，細胞內的吸收量最大，且分布于細胞質和細胞核中，與其它各組相比＃＃P＜0.01。

6、
　　3.石斛酚、丁香酸分別作用于HLEC細胞時，0.5h后細胞內即有少量熒光分子出現(xiàn)，細胞內熒光強度極弱，藥物攝入量較少;隨著時間的推移，細胞內的熒光強度迅速增加，培養(yǎng)時間為2h時，熒光強度達到峰值，后熒光強度迅速下降。
　　4.石斛酚作用于HLEC細胞時，受能量抑制劑2，4-DNPH與NaN3作用的影響，細胞里的熒光強度較對照組分別下降了64.30％和48.82％;內吞抑制劑mβ-CD和CPZ作用HLEC細胞后，細胞內的

7、熒光強度分別下降了87.02％和84.95％;硫酸蛋白受體競爭抑制劑(Hep)處理后，細胞里的熒光強度下降了67.96％。4℃培養(yǎng)環(huán)境下石斛酚吸收進入細胞的量降低了76.61％。
　　丁香酸作用于HLEC細胞時，受能量抑制劑2，4-DNPH作用的影響，細胞里熒光強度較對照組下降了69.75％，而NaN3作用HLEC細胞后，和對照組相比，無統(tǒng)計差異;內吞抑制劑mβ-CD和CPZ作用HLEC細胞后，細胞里的熒光強度分別下降了88.81

8、％和72.03％; Hep處理后，細胞里的熒光強度下降了54.25％。4℃培養(yǎng)環(huán)境下丁香酸吸收進入細胞的量降低了83.26％。
　　5.石斛酚、丁香酸吸收轉運過程中HLEC細胞膜表面出現(xiàn)凹坑結構:石斛酚作用后，細胞膜表面出現(xiàn)直徑150～300nm，深度40～60nm的小坑，表面粗糙度由17nm變?yōu)?6nm，細胞膜表面主要突出徑粒高度由320～350nm上升到420～450nm，細胞膜表面出現(xiàn)胞吞的凹坑結構。丁香酸作用后，細胞膜表面

9、出現(xiàn)直徑125～350nm，深度約45～75nm的凹坑，平均粗糙度由16nm變?yōu)?8nm，細胞膜表面主要突出徑粒高度由105nm上升到210nm，細胞膜表面出現(xiàn)胞吞的凹坑結構。
　　結論:
　　石斛酚、丁香酸均能靶向性識別HLEC細胞，且跨膜進入HLEC細胞主要分布于細胞質內，吸收轉運存在時間及濃度依賴性。轉運抑制劑及溫度對石斛酚、丁香酸的吸收有較大抑制作用。石斛酚、丁香酸跨膜轉運過程中HLEC細胞膜表面有凹坑出現(xiàn)。因此，石