中藥復(fù)方中綠原酸與綠原酸單體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)制的比較研究.pdf

1、中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究是中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中必須解決的重大和難點(diǎn)課題。藥動(dòng)學(xué)包括藥物的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）四個(gè)方面。其中吸收、分布和排泄直接決定于藥物的跨膜/跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。因此藥物的跨膜/跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是藥動(dòng)學(xué)研究首先要解決的核心問題。 藥物跨膜/跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制依賴于建立合適的藥物體外吸收模型。來源于人結(jié)腸癌細(xì)胞的Caco-2細(xì)胞系和來源于狗腎近曲小管上皮的MDCK細(xì)胞系，是國(guó)際上研究藥物跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的常用模型細(xì)胞。本論文建立

2、了Caco-2、MDCK兩種細(xì)胞模型，以中藥有效成分綠原酸（Chlorogenic Acid）為研究對(duì)象，對(duì)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（CGA）和中藥復(fù)方雙黃連口服液中綠原酸（CGA-SHL）的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)及其機(jī)制進(jìn)行了較詳盡的比較研究，為復(fù)方中藥的藥動(dòng)學(xué)研究提供可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。 1.細(xì)胞單層模型的建立與驗(yàn)證。 采用美國(guó)組織培養(yǎng)中心（American tissue culture center， ATCC）的Caco-2、MDCK細(xì)胞

3、株，Millipore公司的Millicell系統(tǒng)，建立了Caco-2、MDCK細(xì)胞單層模型。通過顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特征，采用跨膜電阻（The trans-epithelia electrical resistance，TEER）和熒光素鈉透過等方法對(duì)細(xì)胞單層模型進(jìn)行質(zhì)控，結(jié)果顯示Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)21天左右，TEER值達(dá)到500-700 Ω·c㎡。MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)7天左右，TEER值均大于140 Ω·c㎡。用熒光素鈉進(jìn)行正向透過實(shí)

4、驗(yàn)，2小時(shí)后熒光素鈉在Caco-2細(xì)胞單層的凈透過量為3.76 μg·h-1.cm-2，在MDCK細(xì)胞單層的滲透率為0.79×10-6 cm·s-1，均符合Caco-2、MDCK細(xì)胞模型的要求，表明Caco-2、MDCK細(xì)胞模型建立成功。 2.利用細(xì)胞單層模型探討雙黃連口服液中綠原酸的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。 對(duì)CGA-SHL進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。用M2e酶標(biāo)儀測(cè)定CGA-SHL在不同方向，不同濃度下的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況并計(jì)算累積透過量。在

5、兩種細(xì)胞模型上，CGA-SHL均有不同程度的吸收和分泌。CGA-SHL在Caco-2細(xì)胞模型上的吸收無劑量依賴性。與CGA比較，CGA-SHL吸收快得多，尤其是在吸收早期（30 min），有飽和特征；在MDCK細(xì)胞模型上CGA-SHL的累積吸收量隨時(shí)間逐漸增加，90-120 min達(dá)峰值，其后累積吸收量反而減少。與CGA相比，達(dá)峰時(shí)間短，峰值大；與CGA比較，CGA-SHL在Caco-2細(xì)胞模型上的分泌量較小，且無劑量依賴性特點(diǎn)；CGA

6、-SHL在MDCK細(xì)胞模型上的累積分泌曲線與Caco-2模型的結(jié)果類似：具有飽和性。 在MDCK細(xì)胞單層模型上，CGA-SHL的分泌是一可飽和過程。維拉帕米（Verapamil，VER）顯著抑制CGA-SHL的跨細(xì)胞分泌，特別是對(duì)小劑量，中劑量組CGA-SHL的外排抑制作用強(qiáng)，但對(duì)高劑量組作用弱。合用丙磺舒（Probenecid，PBD）、?；撬幔═aurine，TAU）、青霉素鈉（Benzylpenicillin sodium

7、， PCG-Na）后，CGA-SHL的分泌量均明顯降低。 上述研究證明，CGA和CGA-SHL跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)存在多種轉(zhuǎn)運(yùn)方式，既有被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，又有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，且轉(zhuǎn)運(yùn)是雙向的，即同時(shí)存在吸收和分泌過程，吸收時(shí)有反向的外排，分泌時(shí)有吸收/重吸收的影響。主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程又有多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與，P-糖蛋白（P-gp）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OAT）均介導(dǎo)參與CGA-SHL的分泌。 CGA和CGA-SHL的吸收與分泌均有非常明顯的差異。不能以有效