FHA結(jié)構(gòu)域調(diào)控蛋白GarA通過(guò)改變氨基酸組分調(diào)控基因組在UV和氧化脅迫下的穩(wěn)定性.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的結(jié)核病嚴(yán)重威脅著人類健康，每年有上百萬(wàn)的人感染結(jié)核病，已經(jīng)成為死亡率僅次于艾滋病的全球第二大傳染病。在世界衛(wèi)生組織WHO已經(jīng)發(fā)布了最新的《2013年全球結(jié)核病報(bào)告》中指出:2012年新增結(jié)核病860萬(wàn)例，其中死亡人數(shù)到達(dá)了130萬(wàn)。其主要由于多重耐藥菌和廣泛耐藥菌的出現(xiàn)，以及HIV的共感染，使得結(jié)核病形勢(shì)更加嚴(yán)峻。因此，對(duì)結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌的深

2、入研究迫在眉睫。
　　在各種環(huán)境脅迫下維持基因組的穩(wěn)定性是生物生存和繁殖的關(guān)鍵。結(jié)核菌是人類重大傳染疾病結(jié)核病的致病菌。在分枝桿菌長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，又會(huì)遭遇各種環(huán)境壓力的選擇作用，比如:紫外線照射。結(jié)核分枝桿菌為了在巨噬細(xì)胞和肉芽腫中存活，必須適應(yīng)有氧化壓力。紫外線會(huì)使生物體DNA上兩個(gè)相連的胸腺嘧啶形成胸腺嘧啶二聚體，使DNA鏈發(fā)生斷裂，使復(fù)制酶無(wú)法工作，從而對(duì)生物體造成損傷。氧化壓力是生物在有氧環(huán)境生存必須面對(duì)的一種壓力條件，

3、通過(guò)影響Ca2+濃度引起DNA的損傷[5]。但是，在這么多不利條件下，結(jié)核分枝桿菌的基因組一直保持非常穩(wěn)定，那么維持基因組的穩(wěn)定性在分枝桿菌適應(yīng)外界壓力環(huán)境和侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中就顯得非常重要。
　　有關(guān)研究表明:分枝桿菌進(jìn)化出了一系列的修復(fù)和耐受機(jī)制來(lái)抵抗UV給DNA帶來(lái)的損傷。分析結(jié)核分枝桿菌基因組表明:其基因組含有DNA修復(fù)系統(tǒng)，比如:DNA損傷修復(fù)、核算切除修復(fù)(NER)、基礎(chǔ)切除修復(fù)(BER)、重組修復(fù)、非同源末端連接、

4、SOS修復(fù)等。為了抵抗巨噬細(xì)胞和肉芽腫，結(jié)核分枝桿菌也具有抵抗活性氧調(diào)節(jié)的機(jī)制。在革蘭氏陰性菌中，OxyR蛋白是抵抗氧化壓力重要的組成成分。OxyR是活性氧簇感應(yīng)器，同時(shí)也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括去毒酶（過(guò)氧化氫酶和氫過(guò)氧化物酶）和alkyl氫過(guò)氧化物酶。雖然這幾十年來(lái)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究不斷深入，維持基因組穩(wěn)定性仍然有很多地方還有待研究。
　　FHA的全稱為forkhead-associated domain，是叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域，是許

5、多調(diào)控蛋白的磷酸肽識(shí)別結(jié)構(gòu)域。包含有FHA結(jié)構(gòu)域的蛋白涉及許多細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的過(guò)程，包括細(xì)胞形態(tài)的調(diào)節(jié)、三型分泌系統(tǒng)、孢子形成、碳水化合物的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和乙胺丁醇耐受以及致病菌與宿主之間的相互關(guān)系。在真核生物中，許多包含有FHA結(jié)構(gòu)域的蛋白分布在細(xì)胞核，參與細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的形成和維持，DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　本文研究的GarA蛋白(MSMEG_3647)是典型的含有磷酸化識(shí)別FHA結(jié)構(gòu)域的調(diào)控蛋白。有研究表明，未磷酸化G

6、arA蛋白能與α-酮戊二酸脫羧酶(KGD)、依賴NAD的谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酸合酶的活性(GS)相結(jié)合并對(duì)其的活性產(chǎn)生影響[10]。在結(jié)核分枝桿菌中，GarA蛋白作為一個(gè)典型的FHA結(jié)構(gòu)域調(diào)控蛋白怎么可能只參與代謝功能的調(diào)控呢？本文利用Himarl轉(zhuǎn)座子插入突變庫(kù)，成功篩選了本文篩選到了一株GarA（MSMEG_3647）蛋白突變的恥垢分枝桿菌M.smegmatisΔ GarA，其菌落形態(tài)與M.smegmatis mc2155相

7、比明顯變得光滑，單菌落形態(tài)減小、疏水性系數(shù)明顯增高，生物膜形態(tài)也發(fā)生變化。這表明:GarA(MSMEG_3647)蛋白突變會(huì)引起細(xì)胞壁脂質(zhì)成分的變化。我們的實(shí)驗(yàn)還證明了GarA(MSMEG_3647)蛋白突變的恥垢分枝桿菌M.smegmatisΔ GarA對(duì)紫外線照射耐受及對(duì)H2O2敏感，其可能是與基因組穩(wěn)定性相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)了菌體內(nèi)游離氨基酸代謝及組分也發(fā)生了改變。本研究發(fā)現(xiàn)了一種UV和氧化壓力應(yīng)激的新型分子機(jī)制:GarA蛋白缺失會(huì)引