參與mTRO活性調(diào)控的G蛋白鑒定及豬源T1R1-T1R3感應(yīng)氨基酸篩選和功能研究.pdf

1、骨骼肌是動物機體的重要組成器官，是肉質(zhì)生產(chǎn)中的重要的經(jīng)濟(jì)性狀，也是人體蛋白質(zhì)營養(yǎng)的主要來源。骨骼肌的生長主要取決于蛋白質(zhì)的沉積，蛋白質(zhì)沉積是蛋白質(zhì)合成和降解的差值。mTOR是哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的核心調(diào)節(jié)因子，其活性受細(xì)胞內(nèi)外的一系列信號調(diào)控，包括氨基酸、激素、生長因子和能量狀態(tài)等。G蛋白偶聯(lián)受體T1R1/T1R3是細(xì)胞膜上的一個重要的氨基酸感受器，能夠感應(yīng)胞外氨基酸，通過與其偶聯(lián)的胞內(nèi)G蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的mTOR活性。T1R1/T1

2、R3感應(yīng)氨基酸具有種屬特異性，鼠源T1R1/T1R3能感應(yīng)多達(dá)18種L-氨基酸，人源T1R1/T1R3僅能感應(yīng)L-谷氨酸和L-天冬氨酸，豬T1R1/T1R3最多可能感應(yīng)6種L-氨基酸，包括L-谷氨酸和L-天冬氨酸，以及L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-絲氨酸和L-蘇氨酸。因而，不同種屬通過T1R1/T1R3調(diào)節(jié)mTOR活性的氨基酸種類也可能不一樣。根據(jù)以上問題，本研究主要設(shè)計兩個方面的實驗，其一是鑒定與T1R1/T1R3偶聯(lián)參與mTOR活性

3、調(diào)控的G蛋白，其二是篩選豬源T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸并驗證其功能。得出的主要結(jié)果如下:
　　1、在C2C12和HEK-293細(xì)胞中，G蛋白Gi2參與T1R1/T1R3介導(dǎo)的氨基酸依賴性的mTOR活性調(diào)控。在C2C12和HEK-293細(xì)胞中，Gi2的突變激活顯著(P＜0.05)促進(jìn)了mTOR、mTOR下游靶蛋白p70S6K和mTOR上游激活因子ERK1/2的磷酸化水平，說明Gi2能夠通過影響ERK1/2活性來參與mTOR活性調(diào)控

4、;并且，Gi2的突變激活對AKT的磷酸化水平?jīng)]有顯著影響，說明Gi2對mTOR活性的影響不依賴于PI3K/AKT信號通路。Ca2+螯合劑BAPTA-AM處理會抵消Gi2的突變激活對mTOR、p70S6K和ERK磷酸化水平的促進(jìn)作用，說明Gi2對mTOR活性的調(diào)節(jié)作用依賴于Ca2+信號。Gq的突變激活對mTOR及其下游靶蛋白p70S6K的磷酸化水平?jīng)]有顯著影響，說明在C2C12和HEK-293細(xì)胞中，Gq并不參與T1R1/T1R3介導(dǎo)的氨

5、基酸依賴性的mTOR活性調(diào)控。
　　2、豬源T1R1/T1R3能夠感應(yīng)絲氨酸，調(diào)節(jié)mTOR活性。在HEK-293細(xì)胞中，當(dāng)轉(zhuǎn)染Gi2的突變激活質(zhì)粒時，顯著（P＜0.05）促進(jìn)了ERK報告質(zhì)粒的表達(dá)，但是不同氨基酸處理對ERK報告質(zhì)粒表達(dá)的影響沒有顯著差異;當(dāng)過表達(dá)T1R1和T1R3時，50mmol/L的絲氨酸孵育處理顯著（P＜0.05）促進(jìn)了ERK報告質(zhì)粒的表達(dá)，說明豬源T1R1/T1R3能夠感應(yīng)絲氨酸，調(diào)節(jié)ERK活性。此外，過表

6、達(dá)T1R1和T1R3時，蛋氨酸和亮氨酸處理對報告質(zhì)粒表達(dá)的影響沒有顯著差異，說明豬源T1R1/T1R3不能感應(yīng)蛋氨酸和亮氨酸。過表達(dá)T1R1和T1R3時，絲氨酸的添加會顯著促進(jìn)mTOR、S6K1和ERK1/2的磷酸化，其中10mmol/L的絲氨酸處理效果最為顯著，說明絲氨酸能夠通過ERK1/2調(diào)節(jié)mTOR活性。
　　綜上所述，本研究的結(jié)論是:
　　1、T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸，通過與其偶聯(lián)的G蛋白Gi2調(diào)節(jié)mTOR活性;