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文檔簡(jiǎn)介
1、睪丸是雄性動(dòng)物最重要的生殖器官,主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生精子與合成雄激素,前者在生精小管完成,后者由睪丸間質(zhì)細(xì)胞完成。間質(zhì)細(xì)胞合成的雄激素(主要是睪酮)對(duì)于維持睪丸正常生精功能至關(guān)重要。因此,探討雄性動(dòng)物睪丸雄激素合成及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。然而,雄激素合成不僅受經(jīng)典的下丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)控,也受間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)通路局部調(diào)節(jié)。近年來(lái),有研究表明甜味受體T1R3(Taste receptorfamily1 subunit3,T1R3)及其下游G
2、α-味導(dǎo)素(G proteinα-gustducin,Gα)蛋白在動(dòng)物睪丸組織中共表達(dá)。編碼兩蛋白的基因同時(shí)敲除后,小鼠表現(xiàn)為雄性不育,并伴隨精液量減少,精子活力低下、形態(tài)異常,生精上皮脫落等表型,提示甜味覺(jué)T1R3及Gα是調(diào)控雄性生殖的潛在位點(diǎn),然其具體作用尚未明確。鑒于睪丸甜味覺(jué)分子的潛在生物學(xué)功能,甜味劑作為食品與飼料添加劑在日常生活與生產(chǎn)中大量使用,可能與逐年遞增的雄性生殖障礙發(fā)生率存在關(guān)聯(lián),亟待開(kāi)展對(duì)睪丸甜味受體T1R3及其下
3、游信號(hào)參與雄性生殖功能的理論研究?;谶@一主題,本論文以小鼠為研究對(duì)象,探討了出生后不同年齡段睪丸甜味受體T1R3及其下游蛋白Gα的表達(dá)特性;在此基礎(chǔ)上,觀察外源甜味劑對(duì)成年小鼠睪丸生物學(xué)功能及其甜味覺(jué)T1R3與Gα分子表達(dá)的影響;并解析小鼠睪丸甜味覺(jué)T1R3與Gα分子參與睪丸類(lèi)固醇激素合成的潛在信號(hào)機(jī)制;通過(guò)哺乳期人工甜味劑處理驗(yàn)證小鼠初情期睪丸甜味分子參與間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇激素合成調(diào)控cAMP信號(hào)機(jī)制。通過(guò)上述研究,初步揭示了甜味覺(jué)受體
4、T1R3及其下游蛋白Gα在睪丸中的非味覺(jué)功能。其成果,可為雄性不育機(jī)制及甜味劑的合理劑量提供理論儲(chǔ)備和技術(shù)支持。主要結(jié)果如下:
1甜味受體T1R3及其下游蛋白Gα在新生仔鼠睪丸組織中的發(fā)育表達(dá)模式
Western blot結(jié)果顯示,甜味受體T1R3及其下游蛋白Gα在不同發(fā)育階段(新生7d、斷奶21d、初情35d、成年56d及老年1.5yr)的小鼠睪丸中呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),且初情期和成年期的表達(dá)顯著強(qiáng)于斷奶期與老
5、年期。免疫組化分析揭示了上述表達(dá)變化主要與生精周期中不同階段睪丸延伸精子細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞T1R3與Gα的差異表達(dá)有關(guān)。新生期與斷奶期小鼠睪丸甜味覺(jué)T1R3與Gα僅在間質(zhì)細(xì)胞微弱共表達(dá);進(jìn)入初情期后,在整個(gè)生精周期的變形精子細(xì)胞(胞質(zhì)與Ⅶ-Ⅷ期變形精子尾部)和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá);成年期后兩蛋白高表達(dá)于整個(gè)生精周期延伸精子細(xì)胞(且延伸精子尾部表達(dá)強(qiáng)于胞質(zhì))和間質(zhì)細(xì)胞中;步入老年后,睪丸T1R3與Gα的整體表達(dá)水平顯著下降。此外,本試驗(yàn)還觀察到小鼠
6、初情后,精子細(xì)胞殘余體和睪丸血管內(nèi)皮細(xì)胞中有T1R3與Gα蛋白表達(dá),而Gα同時(shí)在新生7d小鼠的凋亡精原細(xì)胞中存在。總之,出生后小鼠睪丸生精細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞T1R3與Gα的發(fā)育表達(dá)呈階段依賴性,且在生精細(xì)胞周期中呈現(xiàn)細(xì)胞特異性。
2甜味劑飲食處理對(duì)小鼠睪丸生物學(xué)功能及其甜味覺(jué)T1R3與Gα的影響
甜味劑(糖精鈉或蔗糖)飲食處理35 d對(duì)成年小鼠睪丸生物學(xué)功能的影響呈現(xiàn)出特殊的劑量反應(yīng),其中糖精鈉引起的反應(yīng)與睪丸甜味覺(jué)信號(hào)
7、分子(甜味受體T1R3與其下游蛋白Gα)有關(guān),與蔗糖不同。具體表現(xiàn)為:中劑量與低劑量糖精鈉處理組小鼠體重與睪丸重顯著增加,血清T略有上升,同時(shí),睪丸甜味覺(jué)信號(hào)分子T1R3與Gα,以及類(lèi)固醇激素合成關(guān)鍵因子(中劑量組:StAR、CYP11A1、CYP17A1;低劑量組:StAR)的表達(dá)增強(qiáng);高劑量組糖精鈉處理的小鼠血清生殖激素(T與E2)水平下降,睪丸受損,精子質(zhì)量差,與其睪丸甜味覺(jué)分子T1R3與Gα以及類(lèi)固醇激素關(guān)鍵因子(StAR、CY
8、P11A1、3β-HSD、CYP17A1、17β-HSD)表達(dá)減弱同時(shí)發(fā)生,這可能與激活解離caspase-3有關(guān)。此外,高、中劑量蔗糖處理組中小鼠睪丸與精子的異常伴隨著解離caspase-3表達(dá)增強(qiáng),而對(duì)T1R3與/或Gα味覺(jué)分子表達(dá)無(wú)顯著影響。
3甜味劑誘導(dǎo)的小鼠睪丸甜味覺(jué)T1R3/Gα信號(hào)對(duì)間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇激素合成的急性影響
睪丸內(nèi)糖精鈉與/或hCG微量注射(0h,3h,6h和12h)試驗(yàn)表明睪丸甜味覺(jué)T1R3與
9、Gα分子參與的間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇合成與胞內(nèi)cAMP有關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示,成年小鼠睪丸甜味覺(jué)信號(hào)分子T1R3和Gα與其類(lèi)固醇合成關(guān)鍵因子(StAR、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD)共表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)睪丸內(nèi)注射未對(duì)小鼠睪丸指數(shù)及其睪丸組織形態(tài)產(chǎn)生器質(zhì)性影響,各處理組在處理0h,3h,6h和12h后,血糖濃度變化不明顯。放射免疫分析顯示,糖精鈉引起的血清T與E2增加僅在處理后6h觀察到,且hCG和hCG-糖精鈉引起的血清
10、E2升高也僅發(fā)生在處理后6h,而血清T在處理3h,6h和12h均有顯著增加。盡管6h糖精鈉處理小鼠睪丸T分泌低于hCG和hCG-糖精鈉組,但卻顯著高于生理鹽水組與對(duì)照組;6h糖精鈉組血清E2水平則與hCG和hCG-糖精鈉組相當(dāng),且三個(gè)處理組均高于生理鹽水組與對(duì)照組。此外,Western blot與ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明,6h糖精鈉注射不僅激活睪丸甜味覺(jué)T1R3與Gα蛋白表達(dá),也促進(jìn)了類(lèi)固醇合成關(guān)鍵因子StAR、CYP11A1、3β-HS
11、D和CYP17A1的表達(dá),引起胞內(nèi)cAMP增加。這與預(yù)期結(jié)果相符,睪丸甜味受體T1R3及其下游Gα的激活,促使胞內(nèi)cAMP生成,進(jìn)而誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇激素合成。與此同時(shí),試驗(yàn)結(jié)果還表明6 h hCG與糖精鈉聯(lián)合處理減弱了糖精鈉組睪丸甜味覺(jué)分子(T1R3與Gα)表達(dá)的同時(shí),不僅降低hCG誘導(dǎo)的胞內(nèi)cAMP生成,還抑制hCG或糖精鈉組類(lèi)固醇合成酶(CYP17A1、17β-HSD和3β-HSD)的活性,降低hCG組睪酮分泌量。
4哺
12、乳期糖精鈉注射的小鼠初情期睪丸甜味覺(jué)T1R3與Gα與類(lèi)固醇激素合成的相關(guān)性研究
小鼠哺乳期(1 d-21 d)注射試驗(yàn)表明哺乳期糖精鈉處理影響小鼠初情期睪丸間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇激素合成與調(diào)控。具體表現(xiàn)為:高、低劑量糖精鈉注射可提高新生小鼠斷奶重與其初情期睪丸指數(shù),其中高劑量糖精鈉引起睪丸指數(shù)上升與升高的血清T、血清E2、睪丸T濃度及降低的睪丸LH濃度有關(guān),而低劑量糖精鈉組的睪丸指數(shù)增加與其血清T、血清E2、睪丸T水平的上調(diào)有關(guān)。免疫
13、組化結(jié)果顯示甜味覺(jué)信號(hào)分子(T1R3和Gα)與類(lèi)固醇合成關(guān)鍵因子(StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD)均表達(dá)于初情期小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中。利用Western blot和real time-PCR技術(shù),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)糖精鈉注射可引起小鼠初情期睪丸甜味覺(jué)信號(hào)分子(T1R3和Gα)與類(lèi)固醇合成關(guān)鍵因子(StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD)表達(dá)上調(diào),但對(duì)睪丸T1R2受體無(wú)顯著
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