11β-羥基類固醇脫氫酶1在肝細胞及睪丸間質(zhì)細胞中方向決定機制的研究.pdf

1、11β-羥基類固醇脫氫酶1(11β-HSD1)催化有生物活性的11β-羥基糖皮質(zhì)激素和無活性的11酮基類固醇之間的轉(zhuǎn)換。它的催化方向是由NADP+/NADPH的比例決定的。在肝細胞內(nèi)，11β-HSD1主要表現(xiàn)為還原酶活性，但在睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)，它卻主要表現(xiàn)為氧化酶活性。然而，11β-HSD1催化方向在兩種細胞中不同表現(xiàn)的具體機制還不明確。有人提出11β-HSD1的方向性是由己糖-6-磷酸脫氫酶(H6PDH)調(diào)節(jié)的，己糖-6-磷酸脫氫酶(H

2、6PDH)催化葡萄糖-6-磷酸(G6P)產(chǎn)生NADPH從而促進11β-HSD1成還原酶。在肝細胞內(nèi)，11β-HSD1和H6PDH的催化作用如下圖示。
　　實驗目的:研究大鼠及人體內(nèi)11β-HSD1和H6PDH之間的耦聯(lián)關(guān)系。
　　實驗方法:購買36只90天齡的雄性SD大鼠，每組6只，共分為6組。30只大鼠腹腔內(nèi)注射75 mg/Kg的二甲磺酸乙烷（EDS，一種能夠特異性地去除成年大鼠睪丸間質(zhì)細胞的化合物）。其它6只大鼠注射等體

3、積的溶媒(1∶4，v/v，DMSO/水)，1h后處死作為對照組。處理組大鼠注射EDS后4，7，14，35和90天處死。每組每只大鼠都取一個睪丸，用針在睪丸上刺3個或者更多個孔，并將其浸泡于Bouin液中4℃過夜，然后儲存于4℃的70％酒精中，直至下一步免疫組化處理。每只大鼠的對側(cè)睪丸冷凍在液氮中以進行核酸分析。1）實時定量PCR(Q-PCR):用核糖體蛋白S16(Rps16)作為內(nèi)標，測定Hsd11b1、H6pd、Slc37a4等基因的

4、表達水平;2）免疫組織化學染色:對睪丸切片進行免疫組化染色反映11b-HSD1的組織定位和表達量;3）蛋白印跡法:檢測微粒體中11β-HSD1的表達量和完整性;4）提取純化的睪丸間質(zhì)細胞和肝實質(zhì)細胞，同時制備微粒體蛋白。采用放射薄層層析法檢測11β-HSD1的氧化和還原活性。分光光度法檢測NADPH的活性以及測定NADP+和NADPH的含量;5）應用統(tǒng)計軟件Graphpad對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，且數(shù)據(jù)用單因素方差

5、分析進行分析。
　　實驗結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)，當大鼠睪丸間質(zhì)細胞消失后，Hsd11b1 mRNAs的水平幾乎降到零，而當大鼠睪丸間質(zhì)細胞再生后，Hsd11b1 mRNAs水平上升。當大鼠睪丸間質(zhì)細胞完全消失后，H6pd和Slc37a4 mRNAs的表達水平?jīng)]有發(fā)生任何改變。說明H6pd和Slc37a4 mRNAs不是來自大鼠睪丸間質(zhì)細胞，因為大鼠睪丸間質(zhì)細胞的消除并沒有影響它們的表達。在大鼠完整的肝細胞中，11β-HSD1還原酶的活性是

6、氧化酶活性的3倍，在完整的大鼠睪丸間質(zhì)細胞中，11β-HSD1的氧化酶活性則明顯強于還原酶活性。在完整的大鼠肝細胞內(nèi)，S3483（一種抑制G6P轉(zhuǎn)運的化合物）的使用明顯增加了11β-HSD1的氧化活性降低了其還原活性。而在完整的大鼠睪丸間質(zhì)細胞中S3483對11β-HSD1的氧化活性和還原活性都沒有影響。G6P濃度依賴的增加了大鼠肝微粒體11β-HSD1還原酶的活性，但對大鼠睪丸間質(zhì)細胞的11β-HSD1還原酶活性幾乎沒有影響。G6P增

7、加了人肝微粒體中的11b-HSD1還原酶活性，S3483可以逆轉(zhuǎn)G6P的這種促進作用。人睪丸微粒體中的11β-HSD1還原酶活性和大鼠睪丸間質(zhì)細胞微粒體中的一樣，G6P對其沒有刺激作用，S3483對其也沒有影響。
　　實驗結(jié)論:在大鼠（3倍）或者人（1.5倍）的肝臟微粒體中G6P促進11β-HSD1的還原酶活性，但是在睪丸中卻沒有這種作用。S3483可以逆轉(zhuǎn)G6P介導增加的11β-HSD1還原酶活性。使用睪丸間質(zhì)細胞毒物EDS，其