類固醇受體輔激活因子SRC-3在小鼠電離輻射所致造血損傷中的調(diào)控保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、造血組織對電離輻射極為敏感，是輻射損傷的主要靶器官之一。輻射射線可導(dǎo)致造血細(xì)胞大量凋亡或死亡，使細(xì)胞周期改變，細(xì)胞增殖遲緩，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重造血功能障礙。與此同時(shí)，電離輻射還可降低骨髓中基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目和分泌細(xì)胞因子的能力，進(jìn)一步阻礙輻射后造血機(jī)能的恢復(fù)。因此，盡量保護(hù)殘存造血細(xì)胞的數(shù)量、促進(jìn)照后造血細(xì)胞的增殖和維持照后造血微環(huán)境的穩(wěn)定，是治療輻射后造血損傷的有效措施。而如何同時(shí)在造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)多途徑、多靶點(diǎn)的輻射后保護(hù)，是治療

2、急性放射病造血損傷時(shí)新的思考。
　　類固醇受體輔激活因子-3(steroidreceptorcoactivator-3，SRC-3)是SRC家族中重要的一員，能夠與多種核受體和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，參與激活多條信號通路，完成相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。SRC-3不僅能在機(jī)體中發(fā)揮了廣泛的生物學(xué)功能;更作為促瘤因子參與促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖和生長，以及對抗化療藥物引起的凋亡。已有報(bào)道證實(shí)，SRC-3在惡性血液細(xì)胞中高表達(dá)，并能發(fā)揮促增殖和對抗藥物

3、所致凋亡的作用。因此我們推斷，SRC-3可能在外因所致的造血細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定作用。目前，對SRC-3參與體內(nèi)造血調(diào)控的機(jī)制尚不清楚，關(guān)于在輻射所致造血損傷中的作用更是未見報(bào)道。為了驗(yàn)證SRC-3是否參與了小鼠輻射后造血損傷效應(yīng)，并探明其相關(guān)機(jī)制，我們以SRC-3基因敲除型和野生型小鼠為實(shí)驗(yàn)對象開展了以下實(shí)驗(yàn)。
　　我們通過海外合作的方式從美國休斯敦貝勒醫(yī)學(xué)院引進(jìn)SRC-3基因敲除小鼠的親代小鼠，并在成功繁殖和進(jìn)行基因表型鑒定后，

4、獲得一批理想的SRC-3基因敲除型和野生型實(shí)驗(yàn)用小鼠。在對所得實(shí)驗(yàn)小鼠按照不同基因型分組后，我們以60Coγ射線分別進(jìn)行了6.0Gy和4.5Gy的全身照射(totalbodyirradiation，TBI)，制造了致死劑量照后和亞致死劑量照后兩種不同的動物輻射損傷模型。
　　為了明確SRC-3在小鼠電離輻射所致造血損傷中的效應(yīng)及探討其相關(guān)機(jī)制，我們分別從體內(nèi)、體外兩方面展開實(shí)驗(yàn)。首先，我們評估了SRC-3-/-小鼠和野生型小鼠在輻

5、射后不同的造血損傷效應(yīng)，包括整體效應(yīng)，如小鼠一般情況、死亡率、體重等指標(biāo);外周血細(xì)胞、骨髓造血組織、胸腺和脾臟淋巴組織的損傷情況;并檢測了小鼠血清中造血相關(guān)細(xì)胞因子(IGF-1，IL-3，IL-6，TPO)的水平變化，驗(yàn)證了SRC-3在小鼠體內(nèi)輻射后造血損傷和造血恢復(fù)過程中均能發(fā)揮防護(hù)作用。其次，我們以小鼠細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，分兩部分探討了SRC-3參與調(diào)控和保護(hù)小鼠輻射后造血損傷的機(jī)制:1）以兩種不同基因型小鼠的骨髓有核細(xì)胞(bonem

6、arrownucleatedcells，BMNCs)作為研究對象，在輻射前和輻射后各時(shí)相點(diǎn)，檢測了SRC-3對小鼠BMNCs細(xì)胞的凋亡、增殖、細(xì)胞周期、相關(guān)增殖通路的影響，以及對凋亡相關(guān)分子(NF-κB，p53，Bcl-2，Bax)和周期調(diào)控因子(cyclinA，E，D1，CDK2，CDK4，p21，p53)的調(diào)控作用，闡明了SRC-3在輻射后的小鼠BMNCs中的調(diào)控和保護(hù)作用。2）以兩種不同基因型小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarro

7、wstromalcells，BMSCs)作為研究對象，在輻射前和輻射后各時(shí)相點(diǎn)，檢測了SRC-3對小鼠BMSCs細(xì)胞的增殖活性、成纖維細(xì)胞集落形成單位(colony-formingunitoffibroblast，CFU-F)形成能力、增殖相關(guān)p-AKT蛋白表達(dá)量，和上清中VCAM-1，IGF-1，IL-3，IL-6和TPO水平的影響，明確了SRC-3在小鼠BMSCs細(xì)胞中的調(diào)控作用。所得結(jié)果總結(jié)如下:
　　主要結(jié)果:
　　

8、1.以SRC-3+/-雜合子小鼠為親代交配繁殖得到一定數(shù)目的野生型（SRC-3+/+）、雜合子（SRC-3+/-）和基因敲除的純合子(SRC-3-/-)小鼠。通過PCR和Westernblot方法分別對子代小鼠進(jìn)行基因表型和蛋白表型的鑒定后，將所得SRC-3-/-小鼠SRC-3+/+小鼠分組供實(shí)驗(yàn)用。蛋白表型鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRC-3-/-小鼠中SRC-3基因已經(jīng)徹底敲除，其骨髓、脾臟和胸腺組織中未測得SRC-3蛋白的表達(dá);而野生型小鼠中骨

9、髓細(xì)胞的SRC-3蛋白的表達(dá)水平顯著高于其在脾臟和胸腺中的表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　2.SRC-3-/-小鼠與同齡野生型小鼠比較，具有體重輕、身材短小、發(fā)育遲緩，成年雌鼠性成熟障礙，不易受孕等特點(diǎn)。正常情況下，與野生型比較，SRC-3-/-小鼠體重和血清中IGF-1水平顯著偏低，兩者比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。并且發(fā)現(xiàn)，SRC-3-/-小鼠的外周血中WBC、RBC和PLT計(jì)數(shù)和骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)均略低于野生型;胸腺指數(shù)

10、、脾臟指數(shù)略高于野生型，但兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.給予致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠顯現(xiàn)出更嚴(yán)重的整體損傷效應(yīng)，表現(xiàn)為一般情況更差、體重下降明顯，30天生存率更低，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，提示SRC-3-/-小鼠機(jī)體抗輻射能力更弱。
　　4.給予亞致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠中外周血血象更低，骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和造血集落形成單位計(jì)數(shù)更少，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

11、同時(shí)骨髓病理切片提示所見輻射后SRC-3-/-小鼠的骨髓更空曠。提示SRC-3-/-小鼠輻射后顯現(xiàn)出更加嚴(yán)重的外周血和骨髓的造血損傷效應(yīng)。值得一提的是，SRC-3-/-小鼠的巨核系造血細(xì)胞在輻射后損傷尤重，在照射后11天極低點(diǎn)至隨后恢復(fù)過程中的各時(shí)相點(diǎn)，均可觀察到SRC-3-/-小鼠的外周血PLT計(jì)數(shù)、病理切片中骨髓腔巨核細(xì)胞數(shù)目和體外培養(yǎng)巨核系集落形成單位顯著低于野生型，兩者比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　5.給予亞致

12、死劑量TBI后，在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)可觀察到，SRC-3-/-小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均略高于野生型，并與野生型比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明SRC-3-/-小鼠脾臟和胸腺的輻射后損傷程度明顯低于骨髓損傷程度，因此SRC-3-/-小鼠的淋巴組織在輻射后的損傷效應(yīng)與骨髓組織有所不同。
　　6.給予亞致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠血清中IGF-1水平在照后各時(shí)相點(diǎn)持續(xù)處于較低水平，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。SRC-3-/-小

13、鼠血清中造血因子IL-3和IL-6在照后第7天顯著均低于野生型，兩者比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。血清中細(xì)胞因子TPO水平則未發(fā)現(xiàn)存在組間差異。
　　7.用流式法測定兩組小鼠的BMNCs的凋亡率和所含Sca-1+細(xì)胞比例后發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，兩種小鼠BMNCs的凋亡率和所含Sca-1+細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而輻射后SRC-3-/-小鼠的BMNCs中凋亡率顯著升高和Sca-1+細(xì)胞比例顯著降低，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜

14、0.05)。同時(shí)，用Westernblot方法測得輻射后SRC-3-/-小鼠BMNCs中的凋亡蛋白p53和Bax表達(dá)顯著升高，抗凋亡蛋白NF-κB(p65)和Bcl-2表達(dá)顯著降低，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。提示SRC-3-/-小鼠的BMNCs在輻射后凋亡增多、殘留數(shù)目較少;其增高的凋亡敏感性與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量異常有關(guān)。
　　8.用流式法測定兩組小鼠的BMNCs的細(xì)胞周期和增殖指數(shù)后發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，兩種小

15、鼠BMNCs的細(xì)胞周期分布和增殖指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而輻射后SRC-3-/-小鼠的BMNCs表現(xiàn)出G0/G1期顯著升高，S期阻滯的特點(diǎn)，同時(shí)增殖指數(shù)也顯著低于野生型(P＜0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，輻射后SRC-3-/-小鼠BMNCs中正性周期調(diào)控因子，包括CyclinD1、CyclinE、CyclinA、CDK2、CDK4的表達(dá)水平顯著降低;負(fù)性周期調(diào)控因子p53和p21的蛋白表達(dá)量顯著升高，與野生型比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。并

16、且，SRC-3-/-小鼠BMNCs中p-AKT蛋白表達(dá)量在輻射后下降，表明SRC-3-/-小鼠AKT增殖信號通路在輻射后活性降低。以上結(jié)果提示SRC-3-/-小鼠的BMNCs在輻射后存在細(xì)胞周期分布異常和增殖障礙的特點(diǎn)，其中周期調(diào)控因子的表達(dá)水平和的AKT信號通路活性輻射后降低，是導(dǎo)致輻射后造血恢復(fù)緩慢的重要原因。
　　9.用CKK-8法測定體外培養(yǎng)所得小鼠BMSCs的增殖活性后發(fā)現(xiàn)，正常情況下，SRC-3-/-小鼠的增殖活性顯著

17、低于野生型(P＜0.05);而輻射后兩者組間差異更加顯著(P＜0.01)。并且，SRC-3-/-小鼠的CFU-F形成能力在照前和照后均顯著低于野生型，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。另外，我們還檢測了小鼠BMSCs中調(diào)控增殖的AKT信號通路活性，發(fā)現(xiàn)照前兩組小鼠BMSCs中p-AKT蛋白表達(dá)量水平接近;但在照后SRC-3-/-小鼠BMSCs中p-AKT蛋白表達(dá)量顯著低于野生型，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。以上結(jié)果說明SR

18、C-3-/-小鼠BMSCs的增殖能力和CFU-F形成能力在照射前降低，輻射后程度加重;而照射后SRC-3-/-小鼠BMSCs中AKT增殖信號通路活性降低可能是導(dǎo)致該損害加重的一個(gè)重要原因。
　　10.用ELISA法測定小鼠BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平后發(fā)現(xiàn)，正常情況下，SRC-3-/-小鼠BMSCs上清中VCAM-1和IGF-1水平偏低，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而輻射損傷后，SRC-3-/-小鼠BM

19、SCs上清中VCAM-1、IGF-1、IL-3和IL-6水平均顯著低于野生型，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說明SRC-3-/-小鼠BMSCs分泌細(xì)胞因子的能力顯著低于野生型。
　　結(jié)論:
　　1.缺乏SRC-3可增加致死劑量TBI后小鼠死亡率，表明SRC-3可以影響輻射后小鼠的存活率，在整體水平上提高小鼠對輻射損傷的防護(hù)能力。
　　2.缺乏SRC-3可導(dǎo)致亞致死劑量TBI后，小鼠骨髓損傷更重、造血恢復(fù)更緩慢

20、。因此，SRC-3能減輕小鼠輻射后骨髓造血損傷程度，促進(jìn)造血恢復(fù)，特別是對巨核系造血影響更加明顯。
　　3.SRC-3與維持血清中IGF-1、IL-3和IL-6水平有密切關(guān)系。缺乏SRC-3可導(dǎo)致照射前后血清中的細(xì)胞因子IGF-1顯著降低，以及照射后血清中IL-3和IL-6水平嚴(yán)重不足。
　　4.SRC-3可保護(hù)輻射后小鼠BMNCs中存活的Sca-1+細(xì)胞和降低凋亡細(xì)胞，并通過激活NF-κB(p65)蛋白和抑制p53蛋白輻射

21、后的活性，降低小鼠BMNCs輻射后凋亡敏感性。
　　5.SRC-3可促進(jìn)輻射后小鼠BMNCs的增殖和周期進(jìn)程，降低G0/G1期比例，減少S期阻滯。其機(jī)制與上調(diào)正性周期調(diào)控因子CyclinD1、CyclinE、CyclinA、CDK2、CDK4和下調(diào)負(fù)性周期調(diào)控因子p21和p53的表達(dá)水平，激活A(yù)KT信號通路有關(guān)。
　　6.缺乏SRC-3可導(dǎo)致正常情況下小鼠BMSCs的增殖活性、CFU-F形成能力，以及BMSCs上清中VCAM