融合豬瘟病毒3’非編碼區(qū)報告基因載體構建和表達miR-150shRNA細胞系的建立.pdf

1、microRNA是一種調(diào)節(jié)性的非編碼小分子RNA，其在生命活動中起著重要的作用。microRNA一般作用于靶標分子mRNA的非編碼區(qū)，通過不完全互補配對的方式抑制靶標mRNA的翻譯，從而對靶標基因在轉(zhuǎn)錄后水平進行調(diào)控。研究表明，microRNA在多種病毒感染過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，很可能在對豬瘟病毒(CSFV)的感染起著直接的調(diào)節(jié)作用。這種調(diào)節(jié)可能是由microRNA與CSFV的3'非編碼區(qū)相互作用來實現(xiàn)的。通過生物信息預測，發(fā)現(xiàn)多種

2、microRNA可能在CSFV上有作用位點。為研究microRNA在豬瘟病毒感染中可能起到的作用，本研究構建了綠色熒光蛋白報告系統(tǒng)，以利用綠色熒光蛋白來篩查microRNA在CSFV3’非編碼區(qū)的作用位點；同時還建立了表達miR-150shRNA的PK-15細胞系，為研究microRNA對CSFV感染中的潛在作用打下基礎。本研究獲得以下結(jié)果： 1.在豬臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(SUVEC)上增殖CSFV石門株，對其增殖狀況進行檢測；設

3、計引物，通過RT-PCR方法成功地擴增出了與預期大小相符的CSFV 3’UTR片段，與克隆載體pMD18-T載體連接后，經(jīng)鑒定得到了豬瘟病毒石門株的3’UTR區(qū)域；重組克隆載體經(jīng)酶切回收3’UTR片段，并將其連入真核表達載體pEGFP-C1，經(jīng)酶切以及測序鑒定正確，表明成功地構建了融合豬瘟病毒石門株3’UTR片段的綠色熒光蛋白報告基因質(zhì)粒載體；質(zhì)粒用QIAGENE Plasmid Mini Kit純化，獲得了較高純度的質(zhì)粒DNA。

4、 2.采用RNA22和miRanda等軟件，分別用已知的豬源microRNA和人源mieroRNA對豬瘟病毒基因組進行掃描，總結(jié)了其中可能作用于CSFV基因組上的microRNA，并重點對可能作用于CSFV非編碼區(qū)的microRNA進行了關注，發(fā)現(xiàn)了豬的11個可能與CSFV基因組直接作用的microRNA。 3.設計并合成了表達miR-150的兩條shRNA序列的DNA單鏈，將其退火后與干擾載體pGenesil-1連接并測序鑒