人JNK3真核表達載體的構(gòu)建及穩(wěn)定表達SHSY5Y細胞系的建立.pdf

1、凋亡是由基因調(diào)控的細胞自主性、程序性死亡。在機體的生命活動中，細胞凋亡和抗凋亡呈現(xiàn)出統(tǒng)一的動態(tài)平衡，其間各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和信號分子之間存在著復(fù)雜關(guān)系，調(diào)控著細胞的生存和死亡。研究表明，細胞的凋亡和抗凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNKs）為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）超家族成員之一?，F(xiàn)已證明M

2、APK通路可轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)控細胞凋亡信號，而JNK信號通路則在其中起著十分重要的作用。 在脊椎動物，JNK由jnk1、jnk2、jnk3三種基因編碼，表達的JNK1、JNK2、JNK3蛋白主要位于細胞質(zhì)，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。這3種基因編碼的蛋白產(chǎn)物可通過選擇性剪接產(chǎn)生了10種轉(zhuǎn)錄本。JNK1和JNK2在全身各組織廣泛表達，JNK3僅在腦、心臟、睪丸等組織特異表達。和JNK1、JNK2不同，只有JNK3具有一個含38個氨基酸殘基的

3、延長的N末端特殊區(qū)域。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，JNK3與神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)細胞的增殖和凋亡有密切聯(lián)系，可促進缺血、缺氧和有毒化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的神經(jīng)細胞凋亡。但目前國內(nèi)外對JNK3與腫瘤之間關(guān)系的研究尚不明確。因此，本課題應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建人JNK3真核表達載體，再穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細胞瘤（SHSY5Y）細胞，分析其JNK3的表達，并探討JNK3與腫瘤細胞凋亡的聯(lián)系，為深入研究JNK3的功能奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容主要包括以下兩個部分： 一、JN

4、K3真核表達載體的構(gòu)建及鑒定。方法：以pDBLeu-JNK3為模板，PCR擴增獲得人JNK3基因全長，目的片段定向插入至真核表達載體pEGFP-C3中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)抗生素平板篩選獲得陽性克隆，再分別進行PCR、酶切及測序鑒定。結(jié)果：獲得了長為1269bp的人JNK3編碼區(qū)全長DNA片段，并成功地將其定向插入到真核表達載體pEGFP-C3的CMV啟動子下游，構(gòu)建成為包含人JNK3基因的重組質(zhì)粒pEGFP-C3-JNK3，PCR和酶切

5、鑒定證實該重組質(zhì)粒帶有JNK3目的基因片段，DNA測序確認插入片段的序列準確無誤。結(jié)論：真核表達載體pEGFP-C3-JNK3構(gòu)建成功。 二、穩(wěn)定表達人JNK3的SHSY5Y細胞系的建立及其在細胞凋亡方面的研究。方法：通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人JNK3的SHSY5Y細胞系。熒光顯微鏡下觀察重組綠色熒光蛋白的表達，并采用RT-PCR、Western

6、 blot檢測JNK3的表達。以過氧化氫（H2O2）為促凋亡因素，MMT和流式細胞儀檢測各細胞系的細胞增殖及凋亡情況。結(jié)果：經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418抗性篩選6～8周，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-JNK3質(zhì)粒的SHSY5Y細胞系。在該細胞系中JNK3基因能被有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，且在H2O2誘導(dǎo)下，JNK3可明顯抑制細胞增殖及促進細胞凋亡。結(jié)論：穩(wěn)定表達人JNK3的SHSY5Y細胞系建立成功。在H2O2誘導(dǎo)下，JNK3可明顯抑制細胞增殖及促