多種無機和有機砷化物對核因子Nfr2通路及其胞核抑制因子Bach1影響的研究.pdf

1、目的
　　砷是自然界中普遍存在的較豐量的元素之一。環(huán)境中常見的砷化物可分為無機砷化物和有機砷化物兩大類。無機砷化物主要包括三價的亞砷酸鹽和三氧化二砷（俗稱砒霜，arsenictrioxide，As2O3）以及五價的五氧化二砷(arsenicpentoxide，As2O5)、砷酸和砷酸鹽類。而五價的二甲基胂酸(dimethylarsinicacid，DMA(Ⅴ))則是有機砷化物在環(huán)境中的主要存在形式。
　　眾所周知，砷劑具有強

2、烈的毒性，并呈現(xiàn)致癌或致畸效應。研究普遍認為，無機砷的毒性較大，而有機砷相對毒性較低。而近年來一些研究表明，無機砷甲基化代謝中間產(chǎn)物甲基亞胂酸(monomethylarsonousacid，MMA(Ⅲ)）和二甲基亞胂酸(dimethylarsonousacid，DMA(Ⅲ))的毒性要遠遠超過無機三價砷。還有一些研究則一致證實了DMA(Ⅴ)的細胞毒性、遺傳毒性以及致癌作用。
　　另一方面，不同無機和有機砷化物對人和動物具有不同的藥用

3、價值。很早人們就使用無機砷化物來治療牛皮癬、慢性支氣管哮喘、慢性皮膚病、寄生蟲病和貧血等。目前臨床上使用As2O3能夠有效地治療急性早幼粒細胞白血病。而多種人工合成的有機砷化合物可用于治療梅毒和抗寄生蟲病。還有證據(jù)表明，適量的砷劑可刺激生血，并促進細胞的生長和繁殖。2010年底，美國航空航天局(NASA)在Science雜志上公布其科研成果并提出砷可能是六大基本生命元素之外的第七種元素的假說。盡管目前對于砷是否是人類必需元素尚不能完全定

4、論，但不同無機和有機砷化物可能具有的這些重要生理功能和潛在的生物學效應正日益在全球科學界引起極大的興趣。
　　核因子Nrf2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2)通路是人類目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物體內(nèi)一套復雜的內(nèi)源性應答機制，主要用來對抗外源性刺激和氧化損傷。生理狀態(tài)下，Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1(Kelch-likeECH-associatedprotein1)緊密結合并使其活性處于

5、相對抑制狀態(tài)。氧化應激刺激下，Nrf2和Keap1解偶聯(lián)后轉(zhuǎn)移入核，與抗氧化反應元件(antioxidantresponseelement，ARE)結合，啟動Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，提高細胞的抗氧化應激能力。
　　另一方面，Bach1(BTBandCNChomology1)是存在于細胞核中的一種轉(zhuǎn)錄抑制因子。研究已明確，Bach1能與Nrf2競爭性結合ARE，從而下調(diào)抗氧化酶的基因表達。因此，在Bach1的抑制作用消除后，

6、即可實現(xiàn)氧化物促進基因的誘導。也有研究提出，Bach1的細胞核輸入/輸出對于Nrf2活化及其下游靶分子的表達很可能具有重要的調(diào)控作用。
　　目前的研究已經(jīng)明確，亞砷酸鈉(sodiumarsenite，NaAsO2)是體內(nèi)多種組織和細胞中Nrf2通路的強烈誘導劑。而其他無機和有機砷化物，是否與NaAsO2具有相似的Nrf2通路活化的作用;不同無機和有機砷化物對Nrf2下游不同的靶分子的調(diào)控作用是否存在差異，尚缺乏實驗證據(jù)。不同無機和

7、有機砷化物能否影響Nrf2的胞核抑制因子Bach1的核轉(zhuǎn)位，從而間接地調(diào)控Nrf2蛋白及其下游靶分子的表達誘導，也有待闡明?；诖耍狙芯恳詿o機砷暴露誘發(fā)核因子Nrf2通路活化為出發(fā)點，結合不同無機和有機砷化物在化學性質(zhì)、毒性和作用特點，以及生物學效應等方面存在的明顯差異，試圖觀察和探索不同無機和有機砷化物暴露對細胞內(nèi)Nrf2通路和該通路的抑制因子Bach1的影響，及其可能存在的調(diào)控差異。此外，本研究還初步探討了Bach1在無機和有機砷

8、化物誘導Nrf2通路活化中的重要調(diào)控作用。
　　實驗方法
　　一、細胞培養(yǎng)和砷處理
　　Chang肝細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中（含10％FBS，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素），37℃，5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中。
　　細胞染毒:分別用不同濃度的NaAsO2(10、25和50μM)、As2O3(10、20和30μM)、Na2HAsO4(0.5、1和2mM)以及C2H7AsO2(1、2.5和5

9、mM)分別處理Chang肝細胞(0.5h、1h、2h、4h、6h、12h和24h)。
　　二、MTT法檢測細胞活力
　　染毒結束后，每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)振蕩使結晶物充分溶解。用酶標儀在490nm處測定各孔的光密度(OD)值。細胞活力用MTT的還原率表示。
　　三、WesternBlot免疫印跡檢測蛋白表達
　　細胞總蛋白和細

10、胞胞核胞漿蛋白組分的分離和WesternBlot用于檢測Nrf2，Bach1,HO-1,NQO1,GR,GSTO1/2,γ-GCSc,γ-GCSm,LaminB和β-actin蛋白表達水平
　　四、抗氧化反應元件報告基因活性檢測
　　Chang肝細胞轉(zhuǎn)導含ARE報告基因的病毒顆粒后，應用1.2μg/ml嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基篩選細胞為穩(wěn)定細胞系。熒光素酶的活性測定采用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，按照試劑盒說明書操作。熒光素酶活性

11、用細胞活力校正。細胞活力用MTT方法分析檢測。
　　五、免疫熒光檢測
　　4％多聚甲醛固定10min，0.2％Triton(Ⅹ)-100通透15min。滴加Bach1Ⅰ抗，4℃濕盒內(nèi)過夜。次日，PBS洗3次，熒光素酶標記的Ⅱ抗37℃濕盒避光孵育60min。5μg/mlDAPI孵育10min。封片，避光，熒光顯微鏡下觀察。
　　六、實時定量RT-PCR分析基因表達
　　應用TRIzol法提取總RNA，經(jīng)PrimeS

12、cript反轉(zhuǎn)錄酶和OligodT，Random6mers，dNTP轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光染料SYBRGreenPCR試劑盒被用于實時定量PCR分析。實時熒光檢測使用ABIPRISM7500SequenceDetector(AppliedBiosystems)檢測
　　七、統(tǒng)計學分析
　　數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，統(tǒng)計結果表示為mean±SD，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計學差異，p＜0.05具有統(tǒng)計學意

13、義。
　　實驗結果
　　一、不同無機和有機砷化物對Chang肝細胞Nrf2蛋白表達的影響
　　不同濃度的NaAsO2(10、25和50μM)、As2O3(10、20和30μM)、Na2HAsO4（0.5、1和2mM）以及C2H7AsO2(1、2.5和5mM)分別處理Chang肝細胞6h。Nrf2蛋白表達顯著增加，并呈現(xiàn)劑量依賴關系。
　　二、不同無機和有機砷化物對Chang肝細胞Nrf2轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　

14、已經(jīng)穩(wěn)定表達ARE-熒光素酶基因的Chang肝細胞暴露于NaAsO2(10、25和50μM)、As2O3(10、20和30μM)以及Na2HAsO4(0.5、1和2mM)6h后，熒光素酶活性呈劑量依賴性的增加，且不同濃度的無機砷處理組與對照組比較有顯著性差異。而C2H7AsO2(1、2.5和5mM)作用于Chang肝細胞6h后，隨著濃度的增加，ARE-熒光素酶活性并未增高，且與對照相比，反而有下降的趨勢。
　　三、不同無機和有機砷

15、化物對Nrf2調(diào)控的下游靶分子蛋白表達的影響
　　我們發(fā)現(xiàn)三種無機砷暴露后，Ⅱ相解毒酶（HO-1和NQO1）以及谷胱甘肽相關蛋白（GR、GSTO1/2、γ-GCSc/m）表達均顯著高于對照組，且表達水平隨時間延長逐漸增加。Chang肝細胞暴露1mMC2H7AsO2后，隨著暴露時間的延長，與谷胱甘肽合成和代謝相關蛋白表達有所增加;但在6-24h整個暴露時間內(nèi)，Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO1蛋白一直處于對照水平，并無誘導表達。
　

16、　四、多種無機和有機砷化物對Nrf2和Bach1蛋白核質(zhì)分布的影響
　　Chang肝細胞暴露于不同濃度的NaAsO2、As2O3、Na2HAsO40.5、1、2和4h，Nrf2蛋白在核中迅速蓄積，顯著增加;相反，隨著暴露時間的延長，Bach1的全細胞蛋白提取物逐漸蓄積;細胞核中的Bach1蛋白逐漸缺失，漿中Bach1蛋白表達增多。與三種無機砷相似的是，C2H7AsO2也能夠引起核中Nrf2蛋白表達的增加，但C2H7AsO2除了在胞

17、漿中可見少量的Bach1蛋白外，全細胞和胞核中Bach1的蛋白沒有明顯的表達和變化。
　　五、Bach1在無機和有機砷化物誘導Nrf2通路活化中的調(diào)控作用
　　1、不同砷化物及Nrf2和Bach1調(diào)節(jié)劑對Chang肝細胞Nrf2和Bach1蛋白核質(zhì)分布的影響
　　MG132處理Chang肝細胞4h引起Nrf2蛋白在全細胞中廣泛積累，而且增多的Nrf2蛋白主要轉(zhuǎn)移進入細胞核。MG132也引起B(yǎng)ach1蛋白在全細胞積累，但

18、是Bach1蛋白的核質(zhì)分布未發(fā)生改變，沒有明顯的Bach1核輸出現(xiàn)象。Hemin可以引起Chang肝細胞Nrf2總蛋白增加，而且增多的Nrf2蛋白主要轉(zhuǎn)移進入核中。然而Bach1總蛋白未見在全細胞中積累，但是Bach1在核中明顯減少，提示Bach1從胞核易位進入胞質(zhì)，并在胞漿中進一步降解。而三種無機砷NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4產(chǎn)生Nrf2和Bach1全蛋白蓄積，Nrf2核轉(zhuǎn)位以及Bach1核流出的聯(lián)合效應，與Hemin和

19、MG132聯(lián)合作用產(chǎn)生的現(xiàn)象相似。C2H7AsO2處理雖然觀察到Nrf2蛋白在全細胞中積累，且增加的Nrf2蛋白大部分入核。但是Bach1總蛋白以及Bach1的核質(zhì)分布均未見明顯變化，既沒有明顯的Bach1核輸出。
　　2、不同砷化物及Nrf2和Bach1調(diào)節(jié)劑對Chang肝細胞Nrf2和Bach1的mRNA表達的影響
　　MG132不僅可以抑制Nrf2的蛋白降解，而且還能促進其自身mRNA的新合成，同時Bach1的mRNA

20、水平也有所增加。三種無機砷化物(NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4)都能誘導Nrf2和Bach1自身mRNA的增加;而Hemin處理后，Nrf2和Bach1的mRNA表達水平并無增加。同樣我們也觀察到有機砷化物C2H7AsO2也不能誘導Nrf2和Bach1的自身mRNA合成增加。
　　3、不同砷化物及Nrf2和Bach1調(diào)節(jié)劑對Chang肝細胞Nrf2轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　除C2H7AsO2外，三種無機砷化物(NaAs

21、O2、As2O3和Na2HAsO4)以及MG132和Hemin均能誘導Nrf2轉(zhuǎn)錄活性增強。
　　4、不同砷化物及Nrf2和Bach1調(diào)節(jié)劑對Chang肝細胞Nrf2通路下游靶分子的mRNA表達的影響
　　三種無機砷(NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4)都能顯著誘導Nrf2調(diào)控的下游靶分子HO-1、NQO1、GR、GSTO1/2和γ-GCSc/m基因的mRNA水平表達增加;其中對HO-1基因的mRNA誘導能力最強。H

22、emin單獨作用以及MG132與Hemin的聯(lián)合作用都能誘導下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。MG132單獨作用不能誘導HO-1的mRNA表達，但可誘導其他靶分子(NQO1、GR、GSTO1/2和γ-GCSc/m)的mRNA水平表達增加。而C2H7AsO2暴露后，所有檢測的下游基因的mRNA水平均未見增加。
　　5、不同砷化物及Nrf2和Bach1調(diào)節(jié)劑對Chang肝細胞Nrf2通路下游靶分子蛋白表達的影響
　　三種無機砷化物（NaAsO

23、2、As2O3和Na2HAsO4）都能夠顯著誘導Nrf2調(diào)控的下游靶分子蛋白的表達。而MG132和C2H7AsO2不能誘導Nrf2調(diào)控的下游基因HO-1的蛋白表達。Hemin單獨作用以及Hemin和MG132聯(lián)合作用組，都可明顯誘導下游蛋白（HO-1、NQO1、GR、GSTO1/2和γ-GCSc/m）表達。
　　結論
　　1、NaAsO2、As2O3、Na2HAsO4和C2H7AsO2都能誘導Chang肝細胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf

24、2蛋白表達增強。
　　2、NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4三種無機砷能夠增強Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，C2H7AsO2對Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性沒有影響。
　　3、NaAsO2、As2O3、Na2HAsO4和C2H7AsO2都能誘導與GSH合成和代謝相關酶（GR、GST和γ-GCSc/m）的蛋白表達。
　　4、NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4三種無機砷能夠誘導Nrf2調(diào)控的Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO1的表達，而

25、C2H7AsO2對HO-1和NQO1蛋白表達無影響。
　　5、NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4誘導Chang肝細胞Nrf2蛋白的胞核蓄積，同時調(diào)節(jié)Bach1從胞核釋放至胞質(zhì)，進而誘導Nrf2轉(zhuǎn)錄活性增強，以及下游靶分子的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。
　　6、C2H7AsO2雖然能夠誘導Chang肝細胞Nrf2蛋白的胞核蓄積，但不能影響B(tài)ach1的核輸出機制，因而不能誘導Nrf2轉(zhuǎn)錄活性以及下游靶分子的基因轉(zhuǎn)錄。