道地丹皮防治糖尿病腎病優(yōu)效性物質(zhì)基礎(chǔ)的獨特組分結(jié)構(gòu)特征密碼探究.pdf

1、道地藥材是中醫(yī)藥臨床運用瑰寶，在防病治病的過程中扮演著不可或缺的角色。道地藥材，質(zhì)量佳、療效好，其根本原因的不是存在某些獨特成分，大部分情況下也不是某一成分含量越高越好，而是內(nèi)在的化學(xué)成分/組分之間存在的獨特“組分結(jié)構(gòu)特征”密碼。這種特征密碼是道地藥材不同于非道地藥材的本質(zhì)區(qū)別，也是防病治病療效差異的本質(zhì)因素。因此，揭示內(nèi)在的密碼特征，是科學(xué)闡述道地藥材優(yōu)效性的前提，也是臨床防治疾病的科學(xué)依據(jù)。
　　牡丹皮是傳統(tǒng)中藥配方中常見的草

2、藥之一，具有顯著對抗糖尿病腎病活性。目前市場上流通的丹皮產(chǎn)地繁多，不同產(chǎn)地的丹皮功效良莠不齊，這種差異在于內(nèi)在的組成結(jié)構(gòu)密碼特征不一致?！敖M分結(jié)構(gòu)理論”認(rèn)為，道地藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)即由各個組分構(gòu)成，其間具有穩(wěn)定的組成結(jié)構(gòu)密碼特征;組分內(nèi)的各活性成分之間同樣具有穩(wěn)定的組成結(jié)構(gòu)密碼特征;而單獨的活性單體，自身依舊具有獨特的三維結(jié)構(gòu)密碼特征。本課題基于中醫(yī)藥整體觀及“組分結(jié)構(gòu)理論”，通過對道地和非道地丹皮藥效、成分的比較，結(jié)合細胞膜固相色譜技術(shù)對

3、丹皮抗糖尿病腎病整體效應(yīng)物質(zhì)進行快速辨識研究，深入地揭示道地丹皮內(nèi)在的獨特組成結(jié)構(gòu)密碼特征，初步為道地丹皮防治糖尿病腎病的優(yōu)效性提供物質(zhì)基礎(chǔ)本質(zhì)依據(jù)。主要內(nèi)容包括以下幾個部分:
　　1.道地丹皮藥材防治糖尿病腎病活性評價
　　本章基于非酶糖基化學(xué)說，研究丹皮防治糖尿病腎病的一系列藥理效應(yīng)，包括其對基底膜增厚、氧化應(yīng)激、炎癥等的影響。
　　(1)抗基底膜增厚:建立體外細胞模型，通過MTT法、酶聯(lián)免疫吸附實驗等研究丹皮對系

4、膜細胞的增殖以及基底膜增厚的影響。結(jié)果表明道地丹皮能抑制AGEs刺激的細胞增殖，減少FN和ColⅣ分泌、下調(diào)FN蛋白表達和ColⅣ的mRNA表達。說明道地丹皮能明顯抑制ColⅣ及FN的合成，改變基底膜增厚的特征。
　　(2)抗氧化作用:道地丹皮的總抗氧化能力由ABTS法測定，IC50:0.19 g/mL。以細胞內(nèi)ROS為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)AGEs刺激后，紅色熒光顯著增強，不同濃度丹皮作用后，ROS含量有顯著的改善。利用體外細胞實驗和體內(nèi)

5、動物實驗，分別從SOD、CAT、MDA和GSH-Px的水平反應(yīng)道地丹皮的抗氧化水平，結(jié)果表明丹皮能較好的抑制氧化應(yīng)激作用。
　　(3)抗炎作用:以巨噬細胞穿透能力、細胞上清與大鼠血清IL-6和MCP-1含量，大鼠腎臟炎癥蛋白表達、細胞內(nèi)炎癥蛋白表達、RAGE受體表達為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)丹皮能有效降低巨噬細胞穿透能力、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TGF-β1等炎癥蛋白表達。研究結(jié)果表明道地丹皮能有效地對抗AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

6、r>　　通過研究發(fā)現(xiàn)，道地丹皮能夠抑制基底膜增厚、減弱氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，因而，其具有較好的抗糖尿病腎病作用。
　　2.道地丹皮抗糖尿病腎病優(yōu)效性研究
　　目前市場上流通的丹皮產(chǎn)地眾多，為選用抗糖尿病腎病的優(yōu)效性丹皮，本章對不同產(chǎn)地的丹皮進行藥效對比研究。主要采用細胞內(nèi)ICAM-1、TGF-β1和FN的表達研究不同產(chǎn)地丹皮體外效應(yīng);采用測定大鼠血糖，24h尿蛋白和血肌酐水平、血清內(nèi)CAT和GSH-Px活力變化、腎臟ICAM-

7、1、TGF-β1的表達研究不同產(chǎn)地丹皮體內(nèi)效應(yīng);通過聚類分析進行藥效歸類比較。結(jié)果表明傳統(tǒng)安徽銅陵所產(chǎn)道地丹皮具有更優(yōu)的抗糖尿病腎病療效，貴州、浙江、河南丹皮與安徽丹皮藥效相似性較高歸為一大類，在藥效上不存在較明顯的差異;湖南、河北、重慶、甘肅、四川、山東歸為一類，具有藥效顯著性差異。
　　3.道地丹皮抗糖尿病腎病整體效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)組分辨識和解析
　　為揭示道地丹皮效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，本章通過細胞膜固相色譜、血小板固相色譜、體外A

8、GEs生成的非酶糖基化體系對道地丹皮的抗糖尿病腎病整體效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)組分進行辨識。
　　(1)建立細胞膜固相篩選系統(tǒng)，并通過LC/ESI/MS/MS技術(shù)尋找、辨別和歸屬效應(yīng)物質(zhì)標(biāo)志峰，通過不同時間、不同濃度的對比，確定條件為:2×10-4 mg/mL丹皮與系膜細胞共孵育90min。最終發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)丹皮中有8個物質(zhì)為細胞膜固相活性產(chǎn)物，這些物質(zhì)可能是道地丹皮抑制系膜細胞損傷、防治糖尿病腎病的主要活性化合物，分別是牡丹苷B、芍藥苷亞硫酸酯、

9、芍藥苷、四沒食子酰葡萄糖（同分異構(gòu)）、六沒食子酰葡萄糖、牡丹皮苷A、丹皮酚。
　　(2)建立體外AGEs生成的非酶糖基化系統(tǒng)，并通過LC/ESI/MS/MS技術(shù)尋找、辨別和歸屬效應(yīng)物質(zhì)標(biāo)志峰。發(fā)現(xiàn)丹皮提取物與丙酮醛反應(yīng)后，有色譜峰消失或減少，也有色譜峰增加，這些物質(zhì)分別是三沒食子酰葡萄糖、四沒食子酰葡萄糖、沒食子酰芍藥苷、六沒食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷。
　　(3)建立血小板固相色譜系統(tǒng)，通過LC/ESI/MS/MS技術(shù)尋找

10、、辨別和歸屬效應(yīng)物質(zhì)標(biāo)志峰。發(fā)現(xiàn)丹皮提取物與血小板反應(yīng)后，有4個成分存在于解離液中，發(fā)揮效應(yīng)。篩選出的活性物質(zhì)分別為氧化芍藥苷、四沒食子酰葡萄糖、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷。
　　最終發(fā)現(xiàn)道地丹皮抗糖尿病腎病物質(zhì)基礎(chǔ)整體構(gòu)成的13種成分，即牡丹苷B、芍藥苷亞硫酸酯、氧化芍藥苷、芍藥苷、三沒食子酰葡萄糖、四沒食子酰葡萄糖（同分異構(gòu)）、五沒食子酰葡萄糖、六沒食子酰葡萄糖、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、牡丹皮苷A和丹皮酚，主要屬于總

11、苷/酚和鞣質(zhì)組分。
　　4.道地丹皮組成結(jié)構(gòu)特征密碼探究及其優(yōu)化
　　前期研究結(jié)果證實道地丹皮發(fā)揮抗糖尿病腎病的整體效應(yīng)物質(zhì)為總苷/酚和鞣質(zhì)組分，結(jié)合文獻報道的多糖組分，本章主要對道地丹皮進行組分分離富集及其組成結(jié)構(gòu)特征密碼優(yōu)化。
　　(1)通過對總苷/酚、鞣質(zhì)、多糖組分共同采取現(xiàn)代分離、分析技術(shù)，進行分離富集，獲得組分群。通過比較了5種大孔樹脂的吸附、解吸附性能，篩選出D101型大孔樹脂用于丹皮總苷/酚的分離純化;通

12、過比較明膠的濃度和用量、丙酮的濃度，篩選出鞣質(zhì)分離的方法;通過脫蛋白、透析除去小分子純化丹皮多糖。最終獲得的總苷/酚、鞣質(zhì)、多糖組分得率分別為2.89％、0.74％、1.9％，組分構(gòu)成特征密碼為5.78∶1.48∶3.8。
　　(2)通過SOD活性、MDA、IL-6及MCP-1含量測定，對總苷/酚、鞣質(zhì)、多糖組分的組成結(jié)構(gòu)特征密碼進行優(yōu)化設(shè)計，結(jié)果表明，當(dāng)總苷/酚、多糖、鞣質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)特征密碼在5.78∶3.8∶(2.96～4.4

13、4)時，具有更優(yōu)的藥效。
　　(3)經(jīng)過HPLC分析及道地丹皮整體色譜的研究，丹皮組分內(nèi)13個活性物質(zhì)按照一定的組成結(jié)構(gòu)特征密碼存在于藥材中，對牡丹苷B、芍藥苷亞硫酸酯、氧化芍藥苷、芍藥苷、三沒食子酰葡萄糖、四沒食子酰葡萄糖（同分異構(gòu)）、五沒食子酰葡萄糖、六沒食子酰葡萄糖、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、牡丹皮苷A和丹皮酚的峰面積進行構(gòu)成研究，發(fā)現(xiàn)其組成結(jié)構(gòu)特征密碼為1∶0.2∶1.4∶10.4∶0.5∶0.6∶0.6∶2.7∶1.

14、1∶0.7∶1.0∶1.1∶14.9。
　　5.道地和非道地丹皮抗糖尿病腎病優(yōu)效性差異的組成結(jié)構(gòu)特征密碼解析
　　前階段研究表明河北非道地丹皮與安徽道地丹皮藥效差異較顯著，為研究其差異的本質(zhì)，本章對道地與非道地丹皮的藥效成分的組成結(jié)構(gòu)特征密碼進行差異比較（多糖組分未作組分內(nèi)構(gòu)成研究，在此不做討論），并對非道地丹皮進行組成結(jié)構(gòu)特征密碼改造，研究道地丹皮優(yōu)效性的物質(zhì)基礎(chǔ)本質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)特征密碼。
　　(1)結(jié)合峰面積對10個

15、產(chǎn)地丹皮藥效成分聚類分析，對13個物質(zhì)進行歸屬，發(fā)現(xiàn)浙江、河南、安徽為一類，具有相同的組成結(jié)構(gòu)特征密碼。河北產(chǎn)地丹皮藥材為一類，成分構(gòu)成與安徽道地丹皮藥效組分構(gòu)成差異明顯，對其峰面積進行組成結(jié)構(gòu)特征研究，發(fā)現(xiàn)其自身特征的組成結(jié)構(gòu)密碼為1∶0.5∶14.2∶16.5∶0.4∶0.8∶2.2∶2.4∶0.4∶1.7∶1.3∶1.1∶18.7?；谥鞒煞址治龊蛯嶒炇一A(chǔ)，優(yōu)選了6個成分進行組成結(jié)構(gòu)實驗研究，分別為氧化芍藥苷、芍藥苷、三沒食子酰

16、葡萄糖、五沒食子酰葡萄糖、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚，確定道地丹皮和非道地河北丹皮這6種優(yōu)選成分的組成結(jié)構(gòu)密碼構(gòu)成為1∶7.5∶0.3∶0.4∶0.7∶10.7和1∶1.2∶0.03∶0.03∶0.1∶1.3。
　　(2)對藥效及成分構(gòu)成與安徽道地丹皮相差較大的河北丹皮進行優(yōu)選成分組成結(jié)構(gòu)特征密碼構(gòu)成改造，將河北丹皮6種化學(xué)成分氧化芍藥苷、芍藥苷、三沒食子酰葡萄糖、五沒食子酰葡萄糖、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚進行構(gòu)成研究:從自身的組成結(jié)構(gòu)特征