水稻中一個(gè)SUSIBA2相似基因的功能研究.pdf

1、禾谷類作物的胚乳具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。淀粉是谷類作物胚乳中最主要的貯存碳源，它由直鏈淀粉和支鏈淀粉混合而成的，兩者在胚乳中的比例決定了禾谷類作物谷粒的質(zhì)量。胚乳中淀粉的生物合成主要由腺嘌呤-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和脫分支酶(DBE)這4種酶參與完成的，其中后兩者在支鏈淀粉的形成過程中起重要作用。大麥糖信號(hào)因子SUSIBA2是一個(gè)WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠識(shí)別大麥的一種淀粉脫分支酶基因--異

2、淀粉酶基因isol和一種淀粉分支酶基因sbelIb的啟動(dòng)子區(qū)域上的糖響應(yīng)元件SURE，激活isol基因和sbelIb基因的表達(dá)，從而影響胚乳中淀粉的積累狀況。為了了解水稻中是否存在與大麥相似的淀粉合成調(diào)控機(jī)制，本論文進(jìn)行了四個(gè)方面的研究： 1.構(gòu)建了由ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SUSIBA2基因的正反義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)水稻進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。用PCR對(duì)再生苗的潮霉素基因(hpt)、目的基因SUSIBA2、啟動(dòng)子ubi等均進(jìn)行檢測(cè)，共證

3、實(shí)獲得4株轉(zhuǎn)入正義表達(dá)的SUSIBA2基因的T0代植株。 2.根據(jù)SUSIBA2的序列，從水稻基因組序列中搜索到一個(gè)與其相似的WRKY基因，它由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。利用PCR方法從水稻基因組DNA中克隆出該基因的第3外顯子的片段，長(zhǎng)度為455bp，它包含1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域。以此作為干擾序列，構(gòu)建了RNA干擾載體，并對(duì)水稻進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。對(duì)再生苗潮霉素基因(hpt)的PCR檢測(cè)，共獲得16株T0代陽性植株，轉(zhuǎn)化率為8％

4、。于田間種植至結(jié)實(shí)，有2株結(jié)實(shí)率為0，有11株轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)實(shí)率為0.5％-28％之間，表明T0轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí)狀況極不正常。將收獲的正常種子繼續(xù)播種至出苗，再進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有6株在其T1代單株間出現(xiàn)約3：1的hpt基因分離比。 3.在非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)，從水稻幼穗中克隆到該基因的cDNA，長(zhǎng)度為1921bp，其中ORF長(zhǎng)1755bp，可編碼584個(gè)氨基酸。其蛋白序列具有典型的雙WRKY結(jié)構(gòu)域，與大麥的S

5、USIBA2相似度達(dá)81％。本文將該基因命名為SUSIRI。Southern分析表明，SUSIRI在水稻基因組中只有一個(gè)拷貝。Northern blot分析結(jié)果顯示，該基因在稻穗中的表達(dá)活性在水稻抽穗至種子成熟的發(fā)育過程中逐漸減弱。這與SUSIBA2基因在大麥胚乳中的表達(dá)模式有著明顯的不同。 4.已證實(shí)水稻淀粉分支酶sbe1基因是在胚乳中特異表達(dá)的。本研究從水稻基因組中克隆了長(zhǎng)度為849bp的sbe1基因的啟動(dòng)子區(qū)域片段。利用植