β-arrestin2調(diào)控前列腺素受體EP2在芍藥苷抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞異常增殖的作用.pdf

1、滑膜炎癥是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)這一自身免疫性關(guān)節(jié)疾病的特征性病理表現(xiàn),導(dǎo)致成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)的異常增殖活化,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子是引起FLS異常增殖的重要分子。PGE2通過(guò)與G蛋白(stimulatory G protein,Gs)偶聯(lián)的受體EP(E-p

2、rostanoid)信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平或其它途徑是滑膜細(xì)胞活化導(dǎo)致滑膜炎的重要病理機(jī)制之一。β-arrestin與G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupled receptor kinases,GRK)聯(lián)合作用,通過(guò)介導(dǎo)受體脫敏和內(nèi)吞,對(duì)大部分GPCRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用。但在滑膜細(xì)胞對(duì)EP受體信號(hào)的調(diào)節(jié)特點(diǎn)未見(jiàn)報(bào)道。

3、　　課題組研究發(fā)現(xiàn),臨床使用的天然藥物白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP),其活性單體為芍藥苷(paeoniflorin,Pae),可以降低膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠滑膜細(xì)胞中抑制性G蛋白(inhibitory G protein,Gi)的表達(dá),恢復(fù)cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase,PKA)活性。因此,本研究在以往工作的基礎(chǔ)上

4、,以大鼠和人的FLS為對(duì)象,利用PGE2、EP2受體選擇性激動(dòng)劑Butaprost和β-arrestin2的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)等工具,觀察β-arrestin2對(duì)EP2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)和Pae的作用,為進(jìn)一步闡明滑膜炎中FLS過(guò)度增殖的分子機(jī)制及β-arrestin2的作用,深入發(fā)現(xiàn)Pae抑制FLS異常增殖的新機(jī)制,尋找新的藥物作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　目的:從PGE2受體EP2

5、和β-arrestin2的表達(dá)分布變化特點(diǎn),探討PGE2誘導(dǎo)FLS異常增殖的分子機(jī)制以及Pae的作用;觀察EP2選擇性激動(dòng)劑Butaprost作用下,人FLSβ-arrestin2、EP2受體和cAMP水平的動(dòng)態(tài)變化,利用siRNA沉默β-arrestin2的表達(dá)后觀察β-arrestin2對(duì)EP2受體的調(diào)節(jié)作用和細(xì)胞增殖的影響,揭示β-arrestin2在調(diào)控EP2受體內(nèi)吞和滑膜細(xì)胞異常增殖中的作用以及Pae抑制FLS異常增殖的新機(jī)制

6、。
　　方法:本課題以大鼠和人的成纖維樣滑膜細(xì)胞為研究對(duì)象,利用EP2受體選擇性激動(dòng)劑Butaprost為探針,觀察人FLS被活化后EP2、β-arrestin2、cAMP水平的時(shí)間變化情況,揭示滑膜細(xì)胞被活化后細(xì)胞內(nèi)的分子變化規(guī)律;以β-arrestin2的siRNA為工具,明確人FLS中β-arrestin2對(duì)EP2受體的調(diào)控作用和對(duì)PGE2作用下細(xì)胞增殖的影響。并使用PGE2作為刺激因子,探討β-arrestin2和EP2受

7、體在FLS異常增殖時(shí)基因蛋白表達(dá)水平和分布變化特點(diǎn),Gαs表達(dá)和活性以及cAMP水平的變化,同時(shí)觀察Pae對(duì)上述變化的影響,以進(jìn)一步闡明Pae抑制PGE2引起FLS異常增生的分子機(jī)制。組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠和人FLS,波形蛋白免疫組化染色鑒定細(xì)胞類(lèi)型,MTT法確定PGE2和Butaprost刺激FLS增殖的亞適濃度和最適時(shí)間,3H-TdR參入法和 MTT法檢測(cè)Pae1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5 mo

8、l·L-1體外給藥對(duì)PGE2125μg·L-1作用下FLS增殖能力的影響,放免法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FLS膜EP2受體水平,western blot法檢測(cè)FLS EP2和β-arrestin2總蛋白、胞膜蛋白的表達(dá)水平,激光共聚焦觀察Butaprost刺激人FLS0、5、10、20、30、60、120min不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)EP2受體細(xì)胞分布情況,免疫共沉淀法檢測(cè)Gαs活性,siRNA瞬時(shí)沉默人FLS中β-arrestin2

9、基因表達(dá),western blot、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescent quantitation PCR,QRT-PCR)法鑒定干擾效果,EP2和β-arrestin2 mRNA水平采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.β-arrestin2對(duì)EP2受體內(nèi)吞的調(diào)控及FLS異常增殖的影響

10、>　　1.1EP2受體被Butaprost活化后細(xì)胞內(nèi)β-arrestin2、EP2受體分布和cAMP水平的動(dòng)態(tài)變化。
　　Butaprost刺激FLS增殖的亞適濃度為1×10-7 mol·L-1,作用最強(qiáng)在24h左右。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FLS0min時(shí)細(xì)胞膜上EP2受體的平均熒光強(qiáng)度為12.5±1.28,Butaprost的刺激引起FLS平均熒光強(qiáng)度逐漸升高,到20min時(shí)最高,為16.3±0.77,與0min時(shí)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、差異(p<0.01),隨后再刺激細(xì)胞的EP2表達(dá)又開(kāi)始減少,24h時(shí)平均熒光強(qiáng)度為10.3±0.56,較0min時(shí)降低(p<0.05)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Butaprost的刺激引起FLS細(xì)胞膜EP2受體表達(dá)逐漸增多,到20min左右為最多,隨后EP2表達(dá)又逐漸減少,2h時(shí)恢復(fù)到接近0min水平,與流式細(xì)胞術(shù)觀察到的變化特點(diǎn)一致。激光共聚焦顯微鏡觀察到了相同的變化特點(diǎn)。但β-arrestin2細(xì)胞膜表達(dá)在Butaprost

12、刺激20min左右開(kāi)始升高,與0min比較有顯著差異(p<0.05),隨后一直呈上升趨勢(shì)。細(xì)胞內(nèi)cAMP含量在Butaprost刺激后逐漸上升,30min左右較0min時(shí)顯著增高,隨后逐漸減少,2h時(shí)含量低于30min時(shí)水平,至刺激24h左右,cAMP濃度較30min時(shí)顯著降低(p<0.01),并且較0min時(shí)更加減少,差異有顯著性(p<0.05)。以上結(jié)果提示,Butaprost刺激人FLS后細(xì)胞膜EP2受體水平短暫的升高,20min

13、后開(kāi)始減少,間接反映了受體在活化了20min后開(kāi)始從細(xì)胞膜內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。EP2受體在被配體活化后,受體在細(xì)胞膜表達(dá)短暫增多(20min左右),引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平先短暫的上升(30min左右),對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用,隨后EP2受體細(xì)胞膜表達(dá)逐漸減少,同時(shí)cAMP濃度也開(kāi)始下降,24h時(shí)FLS細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖,EP2受體的內(nèi)吞具有時(shí)間依賴(lài)性。
　　1.2β-arrestin2對(duì)Butaprost刺激下EP2受體內(nèi)吞的調(diào)控及FLS異常

14、增殖的影響
　　用siRNA通過(guò)Lipofectamin2000進(jìn)行人β-arrestin2的瞬時(shí)沉默,經(jīng)熒光顯微鏡觀察,siRNA/Lipofectamin2000復(fù)合物去除后再培養(yǎng)48h siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的較多,熒光較強(qiáng),因此確定再培養(yǎng)時(shí)間為48h。經(jīng)RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、western blot預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了人FLS中沉默β-arrestin2基因的有效 siRNA序列為Sense:5’-CCAACCUCAU

15、UGAAUUUGATT-3’,Anti-sense:5’-UCAAAUUCAAUGA GGU UGG TT-3’,基因沉默的效率達(dá)到80％以上。沉默了β-arrestin2基因表達(dá)后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜上EP2受體的表達(dá)發(fā)現(xiàn),Butaprost刺激人FLS0min時(shí),X軸平均熒光強(qiáng)度為2.18±0.26,并隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,1h時(shí)平均熒光強(qiáng)度為3.54±0.77,比0min時(shí)顯著升高(p<0.05),此后仍一直升高,到24h

16、時(shí)平均熒光強(qiáng)度為6.24±1.08。提示當(dāng)β-arrestin2基因被沉默后,EP2受體在激動(dòng)劑刺激下逐漸向細(xì)胞膜聚集,而內(nèi)吞過(guò)程受阻。沉默β-arrestin2基因表達(dá)后可部分取消PGE2引起的人FLS異常增殖,提示β-arrestin2在FLS異常增殖中發(fā)揮了重要作用。
　　2.Pae通過(guò)影響β-arrestin2對(duì)EP2受體的調(diào)控抑制PGE2誘導(dǎo)的FLS異常增殖
　　2.1Pae阻止PGE2作用下EP2受體在FLS膜表

17、達(dá)減少
　　PGE2125μg·L-1刺激24h,誘導(dǎo)大鼠和人FLS異常增殖,降低大鼠FLS細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,減少大鼠和人FLS胞膜EP2受體表達(dá),上調(diào)EP2的總蛋白表達(dá)和人FLS中EP2的基因表達(dá);大鼠FLS中,Pae1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol·L-1不同程度抑制細(xì)胞增殖,Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5mol·L-1顯著恢復(fù)cAMP水平,Pae1×10-6,1×10-5mol·

18、L-1體外給藥顯著升高EP2的胞膜表達(dá),明顯降低細(xì)胞總EP2的表達(dá),人FLS中Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5mol·L-1對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用,Pae1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5 mol·L-1不同程度抑制EP2 mRNA合成,并顯著減少細(xì)胞EP2總蛋白表達(dá)水平,Pae1×10-6,1×10-5 mol·L-1顯著升高細(xì)胞膜EP2的表達(dá),提示Pae通過(guò)抑制EP2受體異常內(nèi)吞,恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)cAM

19、P水平而發(fā)揮抑制FLS異常增殖的作用。
　　2.2Pae減少PGE2作用下FLSβ-arrestin2的總表達(dá)和細(xì)胞膜表達(dá)
　　PGE2125μg·L-1刺激24h,上調(diào)β-arrestin2在FLS中胞膜表達(dá)和基因和蛋白總表達(dá);Pae1×10-6,1×10-5 mol·L-1體外給藥明顯降低大鼠FLS細(xì)胞總β-arrestin2的表達(dá),Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5 mol·L-1可不同程度抑制大鼠FLS胞

20、膜β-arrestin2表達(dá)。Pae1×10-6,1×10-5 mol·L-1對(duì)人FLS中β-arrestin2總表達(dá)和細(xì)胞膜表達(dá)均有明顯的降低作用。提示Pae通過(guò)阻止β-arrestin2合成和轉(zhuǎn)膜,抑制EP2受體的異常脫敏。
　　2.3Pae可以恢復(fù)PGE2作用下FLS低下的Gαs活性
　　人FLS中Gαs表達(dá)水平不受PGE2刺激而發(fā)生變化,且Pae各給藥濃度對(duì)其表達(dá)也沒(méi)有明顯作用,進(jìn)一步檢測(cè)Gαs活性發(fā)現(xiàn),PGE2顯著

21、降低Gαs活性,Pae1×10-6,1×10-5 mol·L-1明顯提高活性Gαs的表達(dá)。提示Pae通過(guò)恢復(fù)Gαs活性,維持了細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,發(fā)揮阻止FLS異常增殖的作用。
　　結(jié)論:
　　1.Butaprost在刺激人FLS早期(20min內(nèi))可以使細(xì)胞膜EP2受體水平短暫升高、細(xì)胞內(nèi)cAMP水平上升(30min左右),此后細(xì)胞膜EP2受體表達(dá)逐漸減少、cAMP濃度降低,細(xì)胞異常增殖。EP2受體的內(nèi)吞和細(xì)胞內(nèi)cAMP水

22、平變化的時(shí)間依賴(lài)性與Butaprost刺激后β-arrestin2細(xì)胞膜表達(dá)逐漸升高有關(guān)。
　　2.β-arrestin2在促進(jìn)激動(dòng)劑刺激下EP2受體從細(xì)胞膜內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)以及在人FLS異常增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　3.Pae可以有效抑制PGE2誘導(dǎo)的FLS異常增殖,其機(jī)制與抑制β-arrestin2的基因和蛋白表達(dá)水平,減少β-arrestin2的胞膜募集,抑制EP2受體異常脫敏,降低EP2受體總表達(dá)但升高細(xì)胞膜EP2受體