β-arrestin2調(diào)控前列腺素受體EP2在芍藥苷抑制成纖維樣滑膜細胞異常增殖的作用.pdf

1、滑膜炎癥是類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)這一自身免疫性關節(jié)疾病的特征性病理表現(xiàn),導致成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)的異常增殖活化,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)和細胞因子是引起FLS異常增殖的重要分子。PGE2通過與G蛋白(stimulatory G protein,Gs)偶聯(lián)的受體EP(E-p

2、rostanoid)信號通路調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平或其它途徑是滑膜細胞活化導致滑膜炎的重要病理機制之一。β-arrestin與G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupled receptor kinases,GRK)聯(lián)合作用,通過介導受體脫敏和內(nèi)吞,對大部分GPCRs信號轉(zhuǎn)導通路具有重要的負調(diào)節(jié)作用。但在滑膜細胞對EP受體信號的調(diào)節(jié)特點未見報道。

3、　　課題組研究發(fā)現(xiàn),臨床使用的天然藥物白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP),其活性單體為芍藥苷(paeoniflorin,Pae),可以降低膠原性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠滑膜細胞中抑制性G蛋白(inhibitory G protein,Gi)的表達,恢復cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase,PKA)活性。因此,本研究在以往工作的基礎上

4、,以大鼠和人的FLS為對象,利用PGE2、EP2受體選擇性激動劑Butaprost和β-arrestin2的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)等工具,觀察β-arrestin2對EP2信號通路的調(diào)節(jié)和Pae的作用,為進一步闡明滑膜炎中FLS過度增殖的分子機制及β-arrestin2的作用,深入發(fā)現(xiàn)Pae抑制FLS異常增殖的新機制,尋找新的藥物作用靶點提供理論依據(jù)。
　　目的:從PGE2受體EP2

5、和β-arrestin2的表達分布變化特點,探討PGE2誘導FLS異常增殖的分子機制以及Pae的作用;觀察EP2選擇性激動劑Butaprost作用下,人FLSβ-arrestin2、EP2受體和cAMP水平的動態(tài)變化,利用siRNA沉默β-arrestin2的表達后觀察β-arrestin2對EP2受體的調(diào)節(jié)作用和細胞增殖的影響,揭示β-arrestin2在調(diào)控EP2受體內(nèi)吞和滑膜細胞異常增殖中的作用以及Pae抑制FLS異常增殖的新機制

6、。
　　方法:本課題以大鼠和人的成纖維樣滑膜細胞為研究對象,利用EP2受體選擇性激動劑Butaprost為探針,觀察人FLS被活化后EP2、β-arrestin2、cAMP水平的時間變化情況,揭示滑膜細胞被活化后細胞內(nèi)的分子變化規(guī)律;以β-arrestin2的siRNA為工具,明確人FLS中β-arrestin2對EP2受體的調(diào)控作用和對PGE2作用下細胞增殖的影響。并使用PGE2作為刺激因子,探討β-arrestin2和EP2受

7、體在FLS異常增殖時基因蛋白表達水平和分布變化特點,Gαs表達和活性以及cAMP水平的變化,同時觀察Pae對上述變化的影響,以進一步闡明Pae抑制PGE2引起FLS異常增生的分子機制。組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠和人FLS,波形蛋白免疫組化染色鑒定細胞類型,MTT法確定PGE2和Butaprost刺激FLS增殖的亞適濃度和最適時間,3H-TdR參入法和 MTT法檢測Pae1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5 mo

8、l·L-1體外給藥對PGE2125μg·L-1作用下FLS增殖能力的影響,放免法測定細胞內(nèi)cAMP濃度,流式細胞術檢測FLS膜EP2受體水平,western blot法檢測FLS EP2和β-arrestin2總蛋白、胞膜蛋白的表達水平,激光共聚焦觀察Butaprost刺激人FLS0、5、10、20、30、60、120min不同時間點時EP2受體細胞分布情況,免疫共沉淀法檢測Gαs活性,siRNA瞬時沉默人FLS中β-arrestin2

9、基因表達,western blot、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和實時熒光定量PCR(real time fluorescent quantitation PCR,QRT-PCR)法鑒定干擾效果,EP2和β-arrestin2 mRNA水平采用RT-PCR和實時熒光定量PCR檢測。
　　結(jié)果:
　　1.β-arrestin2對EP2受體內(nèi)吞的調(diào)控及FLS異常增殖的影響

10、>　　1.1EP2受體被Butaprost活化后細胞內(nèi)β-arrestin2、EP2受體分布和cAMP水平的動態(tài)變化。
　　Butaprost刺激FLS增殖的亞適濃度為1×10-7 mol·L-1,作用最強在24h左右。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)FLS0min時細胞膜上EP2受體的平均熒光強度為12.5±1.28,Butaprost的刺激引起FLS平均熒光強度逐漸升高,到20min時最高,為16.3±0.77,與0min時比較有顯著統(tǒng)計學

11、差異(p<0.01),隨后再刺激細胞的EP2表達又開始減少,24h時平均熒光強度為10.3±0.56,較0min時降低(p<0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Butaprost的刺激引起FLS細胞膜EP2受體表達逐漸增多,到20min左右為最多,隨后EP2表達又逐漸減少,2h時恢復到接近0min水平,與流式細胞術觀察到的變化特點一致。激光共聚焦顯微鏡觀察到了相同的變化特點。但β-arrestin2細胞膜表達在Butaprost

12、刺激20min左右開始升高,與0min比較有顯著差異(p<0.05),隨后一直呈上升趨勢。細胞內(nèi)cAMP含量在Butaprost刺激后逐漸上升,30min左右較0min時顯著增高,隨后逐漸減少,2h時含量低于30min時水平,至刺激24h左右,cAMP濃度較30min時顯著降低(p<0.01),并且較0min時更加減少,差異有顯著性(p<0.05)。以上結(jié)果提示,Butaprost刺激人FLS后細胞膜EP2受體水平短暫的升高,20min

13、后開始減少,間接反映了受體在活化了20min后開始從細胞膜內(nèi)吞進入細胞質(zhì)。EP2受體在被配體活化后,受體在細胞膜表達短暫增多(20min左右),引起細胞內(nèi)cAMP水平先短暫的上升(30min左右),對細胞有保護作用,隨后EP2受體細胞膜表達逐漸減少,同時cAMP濃度也開始下降,24h時FLS細胞出現(xiàn)異常增殖,EP2受體的內(nèi)吞具有時間依賴性。
　　1.2β-arrestin2對Butaprost刺激下EP2受體內(nèi)吞的調(diào)控及FLS異常

14、增殖的影響
　　用siRNA通過Lipofectamin2000進行人β-arrestin2的瞬時沉默,經(jīng)熒光顯微鏡觀察,siRNA/Lipofectamin2000復合物去除后再培養(yǎng)48h siRNA轉(zhuǎn)染進入細胞的較多,熒光較強,因此確定再培養(yǎng)時間為48h。經(jīng)RT-PCR、實時熒光定量PCR、western blot預實驗確定了人FLS中沉默β-arrestin2基因的有效 siRNA序列為Sense:5’-CCAACCUCAU

15、UGAAUUUGATT-3’,Anti-sense:5’-UCAAAUUCAAUGA GGU UGG TT-3’,基因沉默的效率達到80％以上。沉默了β-arrestin2基因表達后,用流式細胞術檢測細胞膜上EP2受體的表達發(fā)現(xiàn),Butaprost刺激人FLS0min時,X軸平均熒光強度為2.18±0.26,并隨著刺激時間延長逐漸升高,1h時平均熒光強度為3.54±0.77,比0min時顯著升高(p<0.05),此后仍一直升高,到24h

16、時平均熒光強度為6.24±1.08。提示當β-arrestin2基因被沉默后,EP2受體在激動劑刺激下逐漸向細胞膜聚集,而內(nèi)吞過程受阻。沉默β-arrestin2基因表達后可部分取消PGE2引起的人FLS異常增殖,提示β-arrestin2在FLS異常增殖中發(fā)揮了重要作用。
　　2.Pae通過影響β-arrestin2對EP2受體的調(diào)控抑制PGE2誘導的FLS異常增殖
　　2.1Pae阻止PGE2作用下EP2受體在FLS膜表

17、達減少
　　PGE2125μg·L-1刺激24h,誘導大鼠和人FLS異常增殖,降低大鼠FLS細胞內(nèi)cAMP濃度,減少大鼠和人FLS胞膜EP2受體表達,上調(diào)EP2的總蛋白表達和人FLS中EP2的基因表達;大鼠FLS中,Pae1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol·L-1不同程度抑制細胞增殖,Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5mol·L-1顯著恢復cAMP水平,Pae1×10-6,1×10-5mol·

18、L-1體外給藥顯著升高EP2的胞膜表達,明顯降低細胞總EP2的表達,人FLS中Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5mol·L-1對細胞增殖有明顯抑制作用,Pae1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5 mol·L-1不同程度抑制EP2 mRNA合成,并顯著減少細胞EP2總蛋白表達水平,Pae1×10-6,1×10-5 mol·L-1顯著升高細胞膜EP2的表達,提示Pae通過抑制EP2受體異常內(nèi)吞,恢復細胞內(nèi)cAM

19、P水平而發(fā)揮抑制FLS異常增殖的作用。
　　2.2Pae減少PGE2作用下FLSβ-arrestin2的總表達和細胞膜表達
　　PGE2125μg·L-1刺激24h,上調(diào)β-arrestin2在FLS中胞膜表達和基因和蛋白總表達;Pae1×10-6,1×10-5 mol·L-1體外給藥明顯降低大鼠FLS細胞總β-arrestin2的表達,Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5 mol·L-1可不同程度抑制大鼠FLS胞

20、膜β-arrestin2表達。Pae1×10-6,1×10-5 mol·L-1對人FLS中β-arrestin2總表達和細胞膜表達均有明顯的降低作用。提示Pae通過阻止β-arrestin2合成和轉(zhuǎn)膜,抑制EP2受體的異常脫敏。
　　2.3Pae可以恢復PGE2作用下FLS低下的Gαs活性
　　人FLS中Gαs表達水平不受PGE2刺激而發(fā)生變化,且Pae各給藥濃度對其表達也沒有明顯作用,進一步檢測Gαs活性發(fā)現(xiàn),PGE2顯著

21、降低Gαs活性,Pae1×10-6,1×10-5 mol·L-1明顯提高活性Gαs的表達。提示Pae通過恢復Gαs活性,維持了細胞內(nèi)cAMP水平,發(fā)揮阻止FLS異常增殖的作用。
　　結(jié)論:
　　1.Butaprost在刺激人FLS早期(20min內(nèi))可以使細胞膜EP2受體水平短暫升高、細胞內(nèi)cAMP水平上升(30min左右),此后細胞膜EP2受體表達逐漸減少、cAMP濃度降低,細胞異常增殖。EP2受體的內(nèi)吞和細胞內(nèi)cAMP水

22、平變化的時間依賴性與Butaprost刺激后β-arrestin2細胞膜表達逐漸升高有關。
　　2.β-arrestin2在促進激動劑刺激下EP2受體從細胞膜內(nèi)吞進入細胞質(zhì)以及在人FLS異常增殖中發(fā)揮關鍵作用。
　　3.Pae可以有效抑制PGE2誘導的FLS異常增殖,其機制與抑制β-arrestin2的基因和蛋白表達水平,減少β-arrestin2的胞膜募集,抑制EP2受體異常脫敏,降低EP2受體總表達但升高細胞膜EP2受體