rIL-1α對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞前列腺素E-,2-受體及G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響和白芍總苷的作用.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性自身免疫性和損傷性關(guān)節(jié)炎，最終導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷。RA的顯著特征是慢性滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的損傷以及系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生。滑膜細(xì)胞在白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和前列腺素 E<,2>(prostaglandin E<,2>，PGE<,2>)的刺激下處于高分泌

2、狀態(tài)，產(chǎn)生更多細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子相互作用，刺激滑膜細(xì)胞過度增生形成血管翳，是引起RA患者軟骨和骨組織損傷的主要原因。迄今為止，RA的發(fā)病機(jī)制還沒有明確。雖然用于治療RA的藥物較多，但由于用藥的持久性和副作用，目前尚無理想的治療RA藥物。自芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從中藥芍藥(paeonia lactiflora Pall)中提取的有效部位，主要成份是芍藥苷，是已經(jīng)被證實(shí)為有效治療RA的傳

3、統(tǒng)中藥。然而，TGP如何發(fā)揮治療慢性系統(tǒng)性疾病如RA的機(jī)制還不清楚。鳥苷酸結(jié)合蛋白(G-protein-coupled receptors，G-protein)，簡稱G蛋白，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。PGE<,2>作為RA發(fā)病中重要的炎性介質(zhì)之一，通過結(jié)合并激活細(xì)胞膜上的PGE<,2>受體(prostaglandins E<,2> receptors，EP)引起一系列生理和病理作用，已知EP是G蛋白偶聯(lián)受體，激活的

4、。EP引發(fā)G蛋白活化及其下游信號(hào)傳遞，如環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平的變化。本研究采用大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，探討了TGP對(duì)CIA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹度、滑膜細(xì)胞分泌功能和增殖能力的影響。另外，本實(shí)驗(yàn)以滑膜細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，闡明TGP對(duì)重組大鼠白細(xì)胞介素1α(recombinam rat IL-1α，rIL-1α)作用下

5、CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-likesynoviocytes，F(xiàn)LS)EP受體的表達(dá)和G蛋白信號(hào)通路的影響。 目的： 闡明TGP對(duì)CIA大鼠FLS功能的影響。實(shí)驗(yàn)通過觀察TGP對(duì)FLS產(chǎn)生PGE<,2>、TNF-α和cAMP的作用，闡明TGP對(duì)滑膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子之間相互作用的影響；分析TGP是否通過PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)cAMP水平、抑制滑膜細(xì)胞增殖和抑制炎性細(xì)胞

6、因子的水平發(fā)揮治療CIA作用。 方法： 大鼠左后足趾、尾根部、背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射雞Ⅱ型膠原(chicken tvpe Ⅱcollagen，C Ⅱ)乳劑制備CIA模型，以TGP(25，50，100 mg·kg<'-1>，ig，d14～d28)治療給藥，GTW(40 mg·kg<'-1>，ig，d14～d28)作為陽性對(duì)照。正常組和模型組給予等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。 足容積法測(cè)量大鼠繼發(fā)側(cè)(右后)足爪腫脹度(Δml

7、)；ELASA法檢測(cè)大鼠血清中抗C Ⅱ抗體的水平。MTT法檢測(cè)滑膜細(xì)胞的增殖反應(yīng)；放射性免疫法測(cè)定PGE<,2>、TNF-α和cAMP的水平。采用Western blot技術(shù)檢測(cè)滑膜組織Gai2蛋白表達(dá)和FLS膜蛋白EP受體亞型EP<,4>蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1、TGP減輕CIA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹度、抑制滑膜細(xì)胞過度增殖和分泌過多炎性細(xì)胞因子以致炎前右后足爪的足爪容積作為d0，致炎后每隔4d測(cè)量一次。同正常組大鼠相比較，

8、d14 CIA大鼠繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度顯著增加，d22～d26達(dá)高峰。TGP(25，50，100 mg·kg<'-1>，d14～d28)可顯著減輕CIA大鼠的足爪腫脹度。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGP(25，50，100 mg·kg<'-1>，d14～d28)明顯抑制滑膜細(xì)胞增殖和分泌IL-1、PGE<,2>和’TNF-α的能力。2．TGP抑制rIL-1α作用下CIA大鼠FLS分泌PGE<,2>和TNF-α的水平細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α和P

9、GE<,2>在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。體外試驗(yàn)中，我們以FLS為觀察對(duì)象，選擇rIL-1α為體外刺激因子，觀察rIL-1α對(duì)FLS分泌 TNF-α和 PGE<,2>的影響。rIL-1α呈濃度/時(shí)間依賴性的提高FLS分泌TNF-α和PGE<,2>水平，TGP(2.5，12.5，62.5，125，25μg·ml<'-1>)不同程度的降低PGE<,2>和 TNF-α水平，呈明顯的量效關(guān)系。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 TGP對(duì)CIA大鼠FLS分泌

10、功能的影響。 3．TGP調(diào)節(jié)炎性因子介導(dǎo)的G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是TGP抑制滑膜細(xì)胞過度分泌功能的重要分子機(jī)制之一。 眾多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)EP受體亞型EP<,4>參與RA的病理生理學(xué)過程。本課題中，Westernblot法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGP升高EP<,4>蛋白表達(dá)，抑制Gαi2的蛋白表達(dá)，上升cAMP水平，抑制滑膜細(xì)胞增殖。提示TGP恢復(fù)PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正常通路，可能是其抑制CIA大鼠FLS亢進(jìn)分泌

11、功能的重要分子機(jī)制之一。 結(jié)論： 1．TGP對(duì)大鼠CIA關(guān)節(jié)局部腫脹有明顯改善作用；TGP抑制滑膜細(xì)胞過度增殖、降低滑膜細(xì)胞分泌PGE<,2>、TNF-α和IL-1。 2．TGP抑制rIL-1α誘導(dǎo)的CIA大鼠FLS分泌PGE<,2>和TNF-α是其抑制滑膜細(xì)胞亢進(jìn)分泌功能的重要特點(diǎn)。 3．TGP調(diào)節(jié) PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)平衡可能是其恢復(fù)CIA大鼠FLS功能和抑制其亢進(jìn)分泌功能的