TNF-α通過(guò)影響前列腺素E-,2-受體及其G蛋白偶聯(lián)信號(hào)調(diào)控大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞功能及白芍總苷的作用.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性的自身免疫性疾病。臨床表現(xiàn)為外周關(guān)節(jié)持續(xù)性、進(jìn)展性滑膜炎，并逐漸出現(xiàn)軟骨侵蝕和骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。全世界的患病率約為1～1.5％?；ぱ装Y是導(dǎo)致軟骨和骨破壞的病理基礎(chǔ)，控制滑膜炎，保護(hù)軟骨是改善癥狀、減低致殘率的關(guān)鍵。RA的發(fā)病有多種細(xì)胞因子的參與，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及前列腺素 E<,2

2、>(prostaglandin E<,2>，PGE<,2>)是其中重要的調(diào)節(jié)因子之一，與RA的發(fā)病密切相關(guān)。PGE<,2>與其受體(E-prostanoid，EP)結(jié)合后，與G蛋白偶聯(lián)，激活G蛋白信號(hào)通路，引起cAMP水平的變化，產(chǎn)生廣泛的級(jí)聯(lián)效應(yīng)。白芍總苷(totalglucosides of paeony,TGP)在臨床上具有較好的治療RA的作用，且不良反應(yīng)少。因此，本實(shí)驗(yàn)采用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced ar

3、thritis，CIA)模型，以滑膜細(xì)胞為研究對(duì)象，深入研究 TNF-α對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞 PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號(hào)通路的影響及TGP的作用。 目的：建立大鼠CIA模型，根據(jù)TGP對(duì)大鼠CIA的關(guān)節(jié)腫脹的改善作用，分析TGP對(duì)滑膜細(xì)胞分泌功能與關(guān)節(jié)腫脹、細(xì)胞增殖與cAMP水平的相關(guān)性，并通過(guò)觀察TGP對(duì)TNF-α作用所引起的滑膜成纖維細(xì)胞PGE2、IL-1β、cAMP水平的影響，明確TNF-α對(duì)CIA大鼠滑膜

4、細(xì)胞增殖的影響；以CIA發(fā)病的靶細(xì)胞——滑膜細(xì)胞上PGE<,2>受體為突破口，選擇滑膜細(xì)胞的PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為切入點(diǎn)，分析TGP是否通過(guò)影響CIA大鼠滑膜細(xì)胞上的EP受體，并進(jìn)而影響滑膜細(xì)胞G蛋白-cAMP信號(hào)通路而發(fā)揮其抑制滑膜細(xì)胞過(guò)度增殖的作用。 方法：大鼠足趾、尾根部、背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射雞Ⅱ型膠原(chicken typeⅡcollagen，CC Ⅱ)乳劑制各CIA模型，以TGP(25、50、1

5、00 mg·kg<'-1>·d<'-1>)灌胃給藥(intragastricadministration，ig)(d14～d28)，雷公藤多苷GTW(40mg·kg<'-1>·d<'-1>)(ig，d14～d28)作為陽(yáng)性對(duì)照。足容積法測(cè)量繼發(fā)側(cè)足腫脹度，MTT法檢測(cè)滑膜成纖維細(xì)胞的增殖反應(yīng)。放射性免疫測(cè)定法檢測(cè)TNF-α作用后滑膜細(xì)胞中cAMP、PGE<,2>、IL-1β的水平。采用Westem blot技術(shù)檢測(cè)滑膜組織中抑制性G蛋白

6、亞基3(inhibitory subunitof Gprotein，Gαi<,3>)、FLS上EP亞型EP2和EP4的表達(dá)。 結(jié)果： 1．TGP對(duì)CIA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎及免疫功能的影響CIA大鼠致敏后14d左右出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)較高，表現(xiàn)為對(duì)側(cè)和前肢足爪腫脹，耳、尾出現(xiàn)炎性結(jié)節(jié)和紅斑并伴有體重下降。TGP(25、50、100mg·kg<'-1>，d14～28)治療組與雷公藤多苷GTW(40mg·kg<'-1>

7、，d14～d28)組均可不同程度改善以上變化，同時(shí)對(duì)由ConA誘導(dǎo)的CIA大鼠胸腺T淋巴細(xì)胞低下的增殖反應(yīng)有明顯的促進(jìn)作用。 2、TGP減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹與其抑制滑膜細(xì)胞分泌PGE<,2>和IL-1β水平密切相關(guān)，提高細(xì)胞cAMP水平是其發(fā)揮抑制滑膜過(guò)度增殖效應(yīng)的重要方面本研究發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞在TNF-a(0.2、2.0、20μg·L<'-1>)濃度刺激下IL-1β、PGE<,2>的水平明顯升高，而TGP(62.5、125、25

8、0mg/L)能明顯抑制其升高?；ぜ?xì)胞在TNF-a(0.2、2.0、20μg·L<'-1>)作用下cAMP水平明顯降低，TGP(31.25、62.5、125、250 mg/L)能恢復(fù)其低下的cAMP水平。TGP(15.625、31.25、62.5、125、250 mg/L)均能夠顯著抑制TNF-α作用產(chǎn)生的滑膜細(xì)胞增殖。 3．調(diào)節(jié)PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的平衡，恢復(fù)由TNF-α引起的EP2及EP4的異常

9、表達(dá)可能是TGP發(fā)揮治療作用的重要分子機(jī)制。 Western blot法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGP體內(nèi)給藥(50，100 mg·kg<'-1>，ig，d14～d28)雷公藤多苷GTW(40mg·kg<'-1>，d14～d28)能明顯抑制CIA大鼠滑膜組織Gαi<,3>的表達(dá)，恢復(fù)Gαs/Gαi的平衡。TNF-α(2.0、20μg·L<'-1>)作用能抑制滑膜細(xì)胞EP亞型EP2、EP4的表達(dá)，TGP(62.5、125、250 mg/L)

10、能恢復(fù)EP4的表達(dá)。提示：調(diào)節(jié)EP4的表達(dá)，維持Gαs/Gαi的平衡，恢復(fù)PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號(hào)的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能是TGP發(fā)揮治療作用的重要分子機(jī)制之一。 結(jié)論： 1．TGP減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹與其抑制滑膜細(xì)胞分泌PGE<,2>和IL-1β水平密切相關(guān)，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平是其發(fā)揮抑制滑膜過(guò)度增殖效應(yīng)的重要特點(diǎn) 2．TGP通過(guò)調(diào)節(jié)PGE<,2>-EP-G蛋白-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的平衡發(fā)揮其