膠原性關節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細胞G蛋白-AC-cAMP與Ras-Raf-MEK-ERK信號轉導的交叉對話及芍藥苷的調節(jié)作用.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(RA)是一種多因素引起的慢性、系統(tǒng)性炎癥疾病。其主要特征是滑膜炎癥，最終導致關節(jié)破壞和變形。研究證明促炎癥細胞因子如白介素-1 （IL-1)、腫瘤壞死因子( TNF-α)和炎癥介質如前列腺素E2(PGE2)在RA發(fā)病中起到重要作用。調節(jié)細胞因子和破壞性酶產(chǎn)生的信號轉導也參與了RA的病理過程，并呈現(xiàn)潛在的治療靶點，如異三聚體鳥苷酸結合蛋白(G protein)和絲裂原活化蛋白激酶( MAPKs)等信號轉導都參與了RA慢性滑膜

2、炎。 本研究建立大鼠CIA模型，分離培養(yǎng)FLS，分別采用rIL-1α(一個炎癥細胞因子)、U0126(MEK1/2選擇性抑制劑)、鹽酸異丙腎上腺素(β受體激動劑)和氨茶堿(Ami），非選擇性磷酸二脂酶(PDEs)抑制劑作用于FLS，首次探討Ras-Raf-MEK-ERK和G蛋白-AC-cAMP兩信號轉導交叉對話的關鍵位點及Pae調節(jié)兩信號轉導交叉對話的作用環(huán)節(jié)。 目的： 1.Iso和Ami分別作用于CIA大鼠FL

3、S，檢測FLS中Ras，Raf,p-MEK1/2和p-ERK1/2表達變化，rIL-1α和U0126分別作用于CIA大鼠FLS，檢測FLS中Gi表達、cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)活性，探討兩信號轉導的交叉對話及關鍵作用交叉位點。 2.根據(jù)FLS中Ras，Raf,p-MEK1/2，p-ERK1/2，Gi，cAMP水平和PKA活性的變化，觀察CIA大鼠FLS在Ami，rIL-1或U0126分別

4、作用下，Pae對Ras-MAPKs和G蛋白-AC-cAMP兩信號轉導交叉對話的影響及通過哪些環(huán)節(jié)發(fā)揮調節(jié)作用。 方法： 用雞Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen，C Ⅱ)免疫Sprague-Dawley(SD)大鼠誘導CIA。在炎癥出現(xiàn)后，灌胃給予CIA大鼠Pae(25，50，100 mg·kg-1)，每天一次。大鼠體重每隔4天稱重一次。用MK-550容積儀每隔4天測量大鼠右后足爪容積。采用0-4分尺度每隔4天評定關

5、節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)。進行大鼠膝關節(jié)組織病理分析。分離和培養(yǎng)FLS。FLS被不同的激動劑、抑制劑或藥物作用如Iso，Ami，rIL-1，U0126或Pae。采用3H-TdR摻入法檢測IL-1的活性。TNF-α和PGE2的產(chǎn)生分別采用125I放免試劑盒測定。運用免疫組化和Western blotting技術檢測滑膜細胞中Gi，Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2的表達。用競爭蛋白結合分析法(com

6、petitive proteinbinding assay,CPBA)檢測滑膜細胞中cAMP水平，用激酶發(fā)光分析法測定滑膜細胞中PKA的活性。 結果： I.CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs與G蛋白-AC-cAMP信號轉導的交叉對話及關鍵作用交叉位點1.大鼠CIA建立與評價。在CIA大鼠中可見明顯的炎癥反應，體重增長緩慢，足爪腫脹，關節(jié)炎指數(shù)升高，伴有關節(jié)滑膜組織增生、血管翳形成和軟骨侵蝕。IL-1活性增強，TNF-α

7、和PGE2的產(chǎn)生增加。 2.CIA大鼠FLS中Gi，Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2的表達。CIA大鼠FLS中Gi，Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2表達增加。Gi，Ras，Raf和p-ERK1/2的表達在d20至d28較高，在d20前后P-MEK1/2的表達較高。 3.Ras-MAPKs信號轉導對G蛋白-AC-cAMP信號轉導的影響。rIL-1α可促進Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ER

8、K1/2的表達，提高Gi蛋白表達、cAMP水平和PKA活性。U0126可抑制rIL-1α誘導的p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達，降低rIL-1α誘導的Gi蛋白表達、cAMP水平和PKA活性。rIL-1α作用15min后，Ras和Raf表達水平開始升高，作用30 min后，Gi表達水平開始升高。U0126作用30 min后，p-MEK1/2表達下降，作用60 min后，cAMP水平和PKA活性開始下降。 這些結果提示Ras

9、-MAPKs路徑的活化可以促進G蛋白偶聯(lián)信號轉導；抑制MAPKs級聯(lián)應答能抑制G蛋白偶聯(lián)信號轉導。 4.G蛋白-AC-cAMP信號轉導對Ras-MAPKs信號轉導的影響及作用交叉位點。Iso可促進Gi蛋白表達，升高cAMP水平和PKA活性，但對Ras，Raf,p-MEK1/2和p-ERK1/2無明顯影響。Ami能抑NRas，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2表達，升高cAMP水平和PKA活性，對Gi蛋白表達無影響。Ami

10、作用15 min時，開始提高cAMP水平和PKA活性；作用30 min時，Ras表達開始下降。 這些結果提示升高cAMP水平和PKA活性能夠抑制Ras-MAPKs級聯(lián)應答；其作用交叉位點可能是通過PKA下調膜蛋白Ras表達，而進一步抑制Ras-MAPKs信號轉導。 II.Pae對CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信號轉導和Ras-MAPKs信號轉導兩信號轉導路徑聯(lián)系的調節(jié)及作用環(huán)節(jié)1.Pae抑制CIA大鼠炎癥反應及

11、FLS中炎癥介質的產(chǎn)生。Pae恢復CIA大鼠降低的體重，抑制足爪腫脹，減低AI，改善組織病理。Pae也明顯抑制FLS中IL-1的活性及TNF-α和PGE2的產(chǎn)生。 2.Pae對CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信號轉導的調節(jié)作用。CIA大NFLS中Gi蛋白表達增加，cAMP水平和PKA活性下降。Pae體內和體外可以抑制Gi蛋白的表達，恢復低下的cAMP水平和PKA活性。 3.Pae對CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs信號

12、轉導的調節(jié)作用。CIA大鼠FLS中Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2的表達增加。體內和體外給予Pae后，Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2的表達明顯下降。 4.Pae調節(jié)CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信號轉導和Ras-Raf-MEK-ERK信號轉導交叉聯(lián)系及作用環(huán)節(jié)。 結論： 1.CIA模型是RA的一個慢性、免疫性炎癥模型。該模型一直廣泛用于RA病理機制的研究和用于評價

13、抗關節(jié)炎藥物。 2.CIA大鼠FLS中，Ras-MAPKs和G蛋白-AC-cAMP信號轉導間存在交叉聯(lián)系。Ras-MAPKs路徑的活化可以促進G蛋白偶聯(lián)信號轉導：抑制MAPKs級聯(lián)應答能抑制G蛋白偶聯(lián)信號轉導。升高cAMP水平和PKA活性能夠抑制Ras-MAPKs級聯(lián)應答；關鍵作用交叉位點可能是通過PKA下調膜蛋白Ras表達，而進一步抑制Ras-MAPKs信號轉導。 3.Pae對CIA大鼠有抗炎和免疫調節(jié)作用。Pae可以

14、抑制CIA大鼠炎癥反應及FLS中炎癥介質的產(chǎn)生。4.Pae調節(jié)CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信號轉導，抑制Gi蛋白的表達，升高cAMP水平，增強PKA活性；Pae調節(jié)CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs信號轉導，抑制Ras-MAPKs級聯(lián)活化；Pae調節(jié)G蛋白-AC-cAMP信號轉導和Ras-MAPKs信號轉導的交叉聯(lián)系，其作用環(huán)節(jié)可能是Pae通過抑制Gi蛋白表達，上調cAMP水平和PKA括性，進一步抑制Ras-MAPKs信號