Hcy誘導(dǎo)的MMP在冠心病發(fā)病機(jī)制中的作用及他汀的逆轉(zhuǎn).pdf

1、目的:
　　 觀察不同濃度同型半胱氨酸(Hcy)對培養(yǎng)的大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達(dá)的影響及動物模型的藥物干預(yù)作用。
　　 方法:
　　 本課題進(jìn)行了細(xì)胞水平和動物水平兩方面的實(shí)驗(yàn)研究:
　　 1、細(xì)胞水平:Wistar大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng),應(yīng)用Zymography和Western blotting技術(shù)鑒定不同濃度梯度及時(shí)間梯度的Hcy對培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞

2、MMP-2蛋白表達(dá)和酶解活性的影響及不同濃度梯度和時(shí)間梯度的瑞舒伐他汀、肝素干預(yù)效果。
　　 2、動物水平:40只LDL受體基因敲除小鼠隨機(jī)分為5組,分別喂以普通飼料、普通飼料+高蛋氨酸(蛋氨酸組)、普通飼料+高蛋氨酸+高脂(對照組)、普通飼料+高蛋氨酸+高脂+肝素、普通飼料+高蛋氨酸+高脂+瑞舒伐他汀喂養(yǎng)3個(gè)月,實(shí)驗(yàn)最終日處死動物,測定了血清Hcy水平、血脂水平；解剖心血管系統(tǒng),蘇丹Ⅳ染色觀察動脈粥樣硬化斑塊形成情況；主動脈竇

3、及主動脈弓部石蠟包埋切片,H&E染色觀察動脈粥樣硬化斑塊面積,免疫組織化學(xué)染色觀察動脈粥樣硬化斑塊處MMP-2表達(dá)情況,主動脈竇部和弓部蛋白提取物Zymography法檢測動脈粥樣硬化斑塊部位MMP-2的酶解活性。
　　 結(jié)果:
　　 一、細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
　　 1、Zymography法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2的活性
　　 ⅰ:Zymography分析發(fā)現(xiàn),藍(lán)色背景上的白色透明條帶分子量為72kDa,即

4、為MMP-2所在的條帶。用酶解明膠量表示MMP-2活性,Hcy在50～1000μmol/L時(shí)增強(qiáng)MMP-2的活性(P<0.01)；而Hcy在5000μmol/L時(shí)抑制MMP-2的活性(P<0.01)；相同濃度Hcy干預(yù)條件下,72h的作用明顯強(qiáng)于48h和24h(P<0.01)。
　　 ⅱ:肝素在7.5～750U/mL濃度下能抑制Hcy(1000μmol/L)對血管平滑肌細(xì)胞MMP-2活性的增強(qiáng)作用；相同濃度肝素干預(yù)條件下,72h

5、的抑制作用強(qiáng)于48h和24h(P<0.01)。
　　 ⅲ:瑞舒伐他汀在10-5～10-9mol/L濃度下能抑制Hcy(1000μmol/L)對血管平滑肌細(xì)胞MMP-2活性的增強(qiáng)作用；相同濃度瑞舒伐他汀干預(yù)條件下,72h的抑制作用強(qiáng)于48h和24h(P<0.01)。
　　 2、Western blotting法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2的表達(dá)
　　 ⅰ:免疫印跡法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中蛋白,條帶分子量為72 kD

6、a,即為MMP-2。Hcy在50～5000μmol/L時(shí)能增強(qiáng)MMP-2的表達(dá)(P<0.01)；相同濃度Hcy干預(yù)條件下,72h的作用明顯強(qiáng)于48h和24h(P<0.01)。
　　 ⅱ:肝素在7.5～750U/mL濃度下能抑制Hcy(1000μmol/L)對血管平滑肌細(xì)胞MMP-2表達(dá)的增強(qiáng)作用；相同濃度肝素干預(yù)條件下,72h的抑制作用強(qiáng)于48h和24h(P<0.01)。
　　 ⅲ:瑞舒伐他汀在10-5～10-9mol/

7、L濃度下能抑制Hcy(1000μmol/L)對血管平滑肌細(xì)胞MMP-2表達(dá)的增強(qiáng)作用；相同濃度瑞舒伐他汀干預(yù)條件下,72h的抑制作用強(qiáng)于48h和24h(P<0.01)。
　　 二、動物實(shí)驗(yàn):
　　 1、血清Hcy水平測定:
　　 ①:標(biāo)準(zhǔn)飼料組血清Hcy水平較其余4組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　 ②:肝素組與對照組、及瑞舒伐他汀組與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。
　　 2

8、、血脂水平測定:
　　 ①:肝素組總膽固醇水平較對照組低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),高密度脂蛋白膽固醇較對照組高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；
　　 ②:瑞舒伐他汀組總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平較對照組低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；
　　 ③:蛋氨酸組血脂水平與標(biāo)準(zhǔn)飼料組之間無顯著性差異；
　　 ④:瑞舒伐他汀與對照組相比能顯著降低血漿OxLDL水平(P<0.05)。
　　

9、 3、Zymograph法檢測動脈粥樣硬化斑塊MMP-2的酶解活性:
　　 ①:肝素組和瑞舒伐他汀組MMP-2酶解活性與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)；
　　 ②:瑞舒伐他汀組對MMP-2酶解活性的抑制作用較肝素組高,2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4、主動脈大體標(biāo)本蘇丹Ⅳ染色動脈粥樣硬化斑塊面積分析:
　　 ①:肝素和瑞舒伐他汀均能顯著抑制LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化

10、斑塊的形成,與對照組之間差異有均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　 ②:瑞舒伐他汀較肝素對LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成的抑制作用更為顯著,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5、主動脈竇石蠟切片H&E染色動脈粥樣硬化面積分析:
　　 ①:肝素和瑞舒伐他汀均能抑制LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化的形成,與對照組之間差異有均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　 ②:瑞舒伐他汀

11、較肝素對LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成的抑制作用更為顯著,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 6、主動脈竇石蠟切片MMP-2免疫組織化學(xué)染色分析:
　　 ①:肝素和瑞舒伐他汀均能抑制LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊處MMP-2的表達(dá),與對照組之間差異有均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　 ②:瑞舒伐他汀組與肝素組之間對LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊處MMP-2表達(dá)的抑