子宮內(nèi)膜異位灶微環(huán)境IL-10+Th17細(xì)胞的形成及作用機制.pdf

1、本課題在體外模擬內(nèi)異癥盆腹腔微環(huán)境，和體內(nèi)動物實驗為研究手段，擬研究ESC和巨噬細(xì)胞來源的IL-27通過何種信號通路和下游轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)這群Th17細(xì)胞分化，進(jìn)一步解析這群細(xì)胞是否通過IL-17A和IL-10促進(jìn)內(nèi)異癥進(jìn)展及病理機制。
　　第一部分 子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔免疫微環(huán)境特征
　　目的：1.分析生育期健康女性及子宮內(nèi)膜異位癥患者盆腹腔免疫微環(huán)境免疫特征。2.促炎性IL-17A及耐受性IL-10細(xì)胞對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞功

2、能的調(diào)控。
　　方法：分別收集生育期健康女性及子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液，應(yīng)用離心法分離腹腔免疫細(xì)胞和腹腔液，采用Flow Cytometry檢測腹腔液免疫細(xì)胞亞群特征，Cytometric Bead Array、ELISA技術(shù)檢測腹腔液細(xì)胞因子的表達(dá)特征。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CD4+Th17及Treg細(xì)胞在腹腔微環(huán)境中共同存在。
　　結(jié)論：子宮內(nèi)膜異位癥早期（Ⅰ-Ⅱ期）以促炎性免疫應(yīng)答為主，炎癥貫穿疾病始終

3、，隨著疾病進(jìn)展，晚期（Ⅲ-Ⅳ期）抗炎性免疫應(yīng)答逐漸產(chǎn)生，逐漸形成免疫耐受優(yōu)勢格局。
　　第二部分 經(jīng)異位灶ESCs訓(xùn)導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞對Th17細(xì)胞分化發(fā)育的影響
　　目的：1.體外模擬子宮內(nèi)膜異位灶微環(huán)境的分子特征。2.經(jīng)異位灶ESC訓(xùn)導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞對Th17細(xì)胞及IL-10+Th17細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)節(jié)機制。
　　方法：原代培養(yǎng)正常(Normal ESCs)，在位(Eutopic ESCs)及異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞Ec

4、topic ESCs)，免疫磁珠分選女性外周血單核細(xì)胞及外周幼稚T細(xì)胞，細(xì)胞純度鑒定＞95％。將3種不同的ESCs分別與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，建立E-M共培養(yǎng)系統(tǒng)，單核細(xì)胞單獨培養(yǎng)或經(jīng)過LPS(100ng/ml)、PGE2(1uM)處理。免疫磁珠分選女性外周血單核細(xì)胞，細(xì)胞純度鑒定＞95％，體外培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞，經(jīng)TCDD或雌孕激素處理48小時后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-27p28表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Bio-plex Arr

5、ay技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，不同ESCs與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，ectopic ESCs組分泌高水平的IL-27，TGF-β1，GM-CSF，RANTES，其中GM-CSF促進(jìn)單核細(xì)胞分化成熟，而RNATES則招募更多的單核巨噬細(xì)胞至異位灶局部。采用免疫組織化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)異位灶間質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)IL-27;外周血單核細(xì)胞經(jīng)TCDD或雌孕激素處理48小時后，高表達(dá)IL-27。與normal ESCs相比，ectopic ESCs表達(dá)更高

6、水平IL-27，eutopic ESCs表達(dá)低水平的IL-27。
　　結(jié)論：體外模擬的異位灶微環(huán)境高表達(dá)IL-27，IL-6，TGF-β1因子。
　　第三部分 異位灶I(lǐng)L-27間接抑制促炎性Th17細(xì)胞分化發(fā)育的分子機制
　　目的：1.過表達(dá)IL-27的ESCs與單核細(xì)胞共培養(yǎng)，體外模擬異位灶微環(huán)境，解析巨噬細(xì)胞功能表型變化。2.經(jīng)過表達(dá)IL-27的ESCs所處理的單核巨噬細(xì)胞間接調(diào)控Th17細(xì)胞的分化。
　　方

7、法：免疫磁珠分選女性外周血單核細(xì)胞及幼稚T細(xì)胞，單核細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后ESCs共培養(yǎng)。共培養(yǎng)48小時后，收集共培養(yǎng)體系中1/2“訓(xùn)導(dǎo)過”的單核巨噬細(xì)胞，加入Trizol，提取RNA;體外培養(yǎng)單核細(xì)胞，加入IL-2或IL-27的中和性抗體，利用ELISA及流式細(xì)胞術(shù)對上述結(jié)果進(jìn)行驗證。利用IntAct數(shù)據(jù)庫預(yù)測Aiolos與Foxp3關(guān)系。
　　結(jié)果：我們利用IntAct數(shù)據(jù)庫預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Aiolos與Foxp3之間是負(fù)性調(diào)控關(guān)系，Aiol

8、os可抑制Foxp3表達(dá)與功能，推測Aiolos可能介導(dǎo)局部微環(huán)境中Th17與Treg分化平衡的偏移。
　　結(jié)論：異位灶微環(huán)境中IL-27促使單核細(xì)胞進(jìn)一步高表達(dá)IL-27和IL-2，間接介導(dǎo)免疫耐受微環(huán)境的形成。
　　第四部分 異位灶I(lǐng)L-27直接調(diào)控IL-10+Th17細(xì)胞分化發(fā)育的分子機制
　　目的：1.解析IL-27對CD4+IL-10+T細(xì)胞分化的影響。2.解析IL-27直接調(diào)控IL-10+Th17分化發(fā)育的

9、分子機制。3.動物實驗驗證。
　　方法：免疫磁珠分選女性外周血單核細(xì)胞或幼稚T細(xì)胞，細(xì)胞純度鑒定＞95％，α-CD3/α-CD28預(yù)包被96孔板4℃孵育16小時，在Th1，Th2，Treg，Th17誘導(dǎo)極化條件下，利用流式細(xì)胞術(shù)分析各亞群細(xì)胞c-MAF表達(dá)水平。
　　結(jié)果：IL-6+TGF-β1誘導(dǎo)較高比例的總CD4+Th17細(xì)胞分化，及低水平的IL-10+Th17細(xì)胞。動物實驗證實，拮抗腹腔中IL-27，能夠抑制異位灶I(lǐng)L

10、-10+Th17細(xì)胞的分化。
　　結(jié)論：異位灶ESCs高表達(dá)IL-27;TCDD及雌孕激素促進(jìn)單核細(xì)胞高表達(dá)IL-27;IL-27可直接抑制naive T向總CD4+Th17細(xì)胞分化，但特異性促進(jìn)IL-10+Th17細(xì)胞分化;當(dāng)Th17極化背景下同時存在IL-27，IL-27抑制促炎性Th17細(xì)胞分化，同時還通過MAF/PRDM1通路促進(jìn)IL-10表達(dá)，特異性誘導(dǎo)IL-10+Th17細(xì)胞分化，參與調(diào)控Th17細(xì)胞功能可塑性及微環(huán)境

11、免疫耐受偏移。
　　第五部分 IL-10+Th17細(xì)胞參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制
　　目的：1.人重組IL-17A對ESC的生物學(xué)行為調(diào)控。2.人重組IL-17A聯(lián)合IL-10對ESC的生物學(xué)行為調(diào)控。3.動物實驗驗證。
　　方法：分別收集正常生育期健康女性及子宮內(nèi)膜異位癥正常、在位子宮內(nèi)膜組織及腹腔異位灶組織，應(yīng)用膠原酶消化、密度梯度離心法分離、培養(yǎng)正常，在位及異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESCs)。流式鑒定ESCs自身

12、IL-17AR的表達(dá)。體外培養(yǎng)并饑餓處理6小時后，分別用不同濃度IL-17A、IL-10、IL-17A聯(lián)合IL-10處理48小時，采用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法檢測細(xì)胞活力，AnnexinⅤ-FITC/PI檢測凋亡;利用Transwell檢測ESCs侵襲能力，粘附試驗盒檢測粘附能力.
　　動物實驗體內(nèi)驗證:利用C57小鼠建模，分為ctrl，IL-27拮抗組，IL-17A拮抗組，IL-10拮抗組，

13、IL-17A及IL-10聯(lián)合拮抗組，每組10只，10％水合氯醛麻醉后，將小鼠自體子宮切為均勻4塊，約2*2*2cm大小，用7/0絲線縫在下腹部及盆腔腹膜上，5/0絲線縫合腹部傷口。術(shù)后2mg/L17β-雌二醇溶液肌注1次，腹腔分別注射中和性抗體50ug，抗生素連續(xù)肌注3天預(yù)防感染。1周后，重復(fù)腹腔注射中和性抗體50ug;2周后通過頸椎脫臼法處死建模小鼠，縱行剖開小鼠腹腔，收集每只小鼠異位病灶并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測異位病灶I(lǐng)L-10+Th1

14、7細(xì)胞的分化發(fā)育水平。
　　結(jié)果：ESCs表達(dá)IL-17A的受體;單獨IL-17A促進(jìn)3種ESCs細(xì)胞活力，促進(jìn)正常ESCs及在位eutopic ESCs凋亡，而抑制異位ectopic ESCs凋亡;單獨IL-17A促進(jìn)正常ESCs及在位eutopic ESCs侵襲能力，抑制異位ectopic ESCs侵襲能力;而單獨IL-17A均降低3中ESCs的粘附能力。而單獨IL-10可增加正常ESCs的細(xì)胞活力，粘附能力和侵襲能力;IL-

15、17A及IL-10聯(lián)合則進(jìn)一步增加正常ESCs的細(xì)胞活力和侵襲能力。動物實驗證實，同時拮抗盆腹腔中IL-17A及IL-10因子，能夠顯著抑制異位灶生長。
　　結(jié)論：IL-10+Th17細(xì)胞通過功能分子IL-10和IL-17A促進(jìn)EMS進(jìn)展。
　　綜上所述，異位灶微環(huán)境中IL-27作用于單核巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞，在病灶局部產(chǎn)生利于免疫耐受的微環(huán)境。本課題為Th17細(xì)胞在子宮內(nèi)膜異位灶微環(huán)境中的分化發(fā)育中闡明了新的分子機制，為解析子