哲羅魚早期發(fā)育階段免疫指標(biāo)變化及vasa基因的克隆與表達分析.pdf

1、哲羅魚生長速度快，肉質(zhì)鮮美，屬珍稀冷水性魚類，具有較高的經(jīng)濟價值。隨哲羅魚人工養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，苗種的需求量不斷增加，高質(zhì)量仔稚魚的大量產(chǎn)出是苗種培育的關(guān)鍵，苗種死亡率高成為制約哲羅魚人工養(yǎng)殖發(fā)展的因素之一。因此迫切需要對哲羅魚早期階段的免疫能力和生殖發(fā)育進行研究。因此，本實驗研究了哲羅魚早期發(fā)育階段的免疫酶活性和抗氧化物含量，睪酮和雌二醇的含量變化，仔稚魚期性腺發(fā)育情況，并對哲羅魚 vasa基因進行克隆和表達分析，結(jié)果如下：

2、　　1、在哲羅魚早期發(fā)育階段，通過測定不同發(fā)育時期堿性磷酸酶(AKP)，酸性磷酸酶(ACP)，超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)活力和還原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量，研究魚體內(nèi)免疫酶活性變化和抗氧化物含量變化，發(fā)現(xiàn)哲羅魚胚胎期ACP活性明顯低于成魚期，說明在胚胎期ACP未發(fā)揮重要作用；但在破膜時，ACP活性顯著升高，推測ACP在哲羅魚出膜期發(fā)揮重要作用。在隨后的仔稚幼魚發(fā)育期，ACP活性一直維持在較高水平，

3、保護魚體。而AKP活性顯著低于ACP。在胚胎期，AKP活性低且有所下降，只在破膜后至破膜后30d短暫升高后再次下降，表明在胚胎期AKP發(fā)揮的作用很小，只在出膜期短暫提高，這可能導(dǎo)致魚體消化吸收能力較弱，對氨基酸等大分子物質(zhì)吸收較困難，推測這可能是導(dǎo)致哲羅魚早期苗種生長速度較緩慢的原因之一。在胚胎至仔稚幼魚期，SOD活性無明顯變化，一直保持在1.46-1.77U之間，表明在哲羅魚早期發(fā)育階段，SOD并沒有起到主要抗氧化作用。同樣，CAT活

4、性也極低，幾乎可以忽略不計，表明在哲羅魚早期發(fā)育階段，CAT也幾乎不發(fā)揮抗氧化作用。而在哲羅魚出膜期，GSH含量顯著增加，達到最大值3.7μmol/gprot，表明在破膜時，GSH發(fā)揮重要的抗氧化作用，促進魚體發(fā)育。在仔魚發(fā)育期，GSH含量雖然低于出膜期的含量，但仍保持較高水平，表明GSH在哲羅魚破膜后至仔稚幼魚階段一直起到重要的抗氧化作用，保護魚體。在胚胎期間，MDA的值都在0.1nmol/mgprot上下浮動，含量很低，表明這期間，

5、哲羅魚的過氧化程度很低。但在出膜期和隨后的仔稚幼魚發(fā)育階段，MDA含量持續(xù)增加，表明破膜后，哲羅魚的脂質(zhì)過氧化程度明顯升高。
　　2、在哲羅魚早期發(fā)育階段，哲羅魚體內(nèi)的雌二醇（E2）含量波動很大。從胚胎初期至破膜前，E2含量持續(xù)升高至峰值，在出膜期，E2含量下降至較低水平。之后，在仔稚魚期，E2含量又開始回升，直至到幼魚期，E2含量又開始降低，且顯著低于胚胎期和仔稚魚期的含量。而睪酮（T）含量，在胚胎期，持續(xù)上升至最高點，直至出膜

6、期時，顯著下降直至最低點，到了仔稚幼魚期，T含量略有回升并保持平穩(wěn)趨勢。這表明E2和T在胚胎期的含量都比在仔稚幼魚期高，在出膜期，E2和T含量都顯著下降，而T含量在出膜期就已降至低水平，而后僅略有回升并保持平穩(wěn)，E2則是在仔魚發(fā)育期顯著回升至高峰，直至幼魚期才再次下降至低水平。在仔魚期，哲羅魚的性腺沿鰾發(fā)育，由系膜懸系，原始性腺基本形成。可觀察到PGCs由腎區(qū)向原始性腺遷移。稚魚期可觀察到性腺處于腎管下方，分列在鰾的兩側(cè)，由系膜相連。呈

7、葉狀。
　　3、對vasa基因克隆，測序結(jié)果表明,哲羅魚vasa基因全長2711bp（GenBank ID：KF554113），開放閱讀框（ORF）長1974bp,編碼658個氨基酸。氨基酸序列含有DEAD蛋白家族所有的9個保守結(jié)構(gòu)域：xYxxPTPVQ，AQTGSGKTA，PTRELINQ，TPGR，DEAD，SAT，RGLD，HRIGRTGR以及GG重復(fù)序列。與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中已知的其他物種的vasa基因序列相比，發(fā)

8、現(xiàn)哲羅魚vasa基因與大西洋鮭的vasa基因相似性最高。與大西洋鮭，虹鱒，白點鮭的vasa相似度分別為93％，92%，91%。這表明，vasa基因序列在鮭科魚中是相當(dāng)保守的。
　　通過半定量和實時熒光定量得到的組織分布可知，在哲羅魚胚胎發(fā)育階段，vasa基因持續(xù)表達，在Ⅰ齡和Ⅱ齡哲羅魚中，vasa基因僅在精巢和卵巢中表達，卵巢中的表達量高于精巢，Ⅰ齡中的表達量高于Ⅱ齡。表明vasa mRNA是母源性的，且僅在生殖細(xì)胞中特異表達，可