小鼠囊胚發(fā)育階段miRNA表達的研究.pdf

1、miRNA是指長度為21-25個核苷酸的小型非編碼RNA家族，由70-90nt的可形成發(fā)夾狀結構的內源性轉錄前體加工而成1。miRNA通過與靶標mRNA的3’UTR區(qū)進行完全或不完全互補配對結合，抑制mRNA的翻譯或直接使mRNA降解，在轉錄后水平調控基因的表達2。miRNA家族的成員在研究秀麗線蟲的發(fā)育轉變過程中作為小分子短暫RNA(stRNA)被發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)miRNA是stRNA中的一個大家族，并且很容易在線蟲、蒼蠅、植物、哺乳

2、動物中找到。miRNA的功能并不局限于發(fā)育調節(jié)，它有著不同的表現(xiàn)形式，還可能控制著生長發(fā)育和生理機能的很多方面。miRNA的廣泛存在與進化保守性，暗示著它在生命活動中具有必不可少的調節(jié)作用，對基因表達、生長發(fā)育和行為等都具有十分廣泛和深遠的效應。
　　大量文獻研究顯示miRNA作為基因表達調控中的一個重要分子，與哺乳動物的發(fā)育密切相關；研究在特定組織和特定發(fā)育階段的miRNA表達意義重大。本課題采用miRNA芯片和RT-PCR的方

3、法，研究小鼠囊胚發(fā)育階段miRNA表達譜，為進一步深入研究miRNA在著床前胚胎發(fā)育過程中的表達和功能奠定基礎。
　　目的：研究小鼠囊胚發(fā)育階段miRNA的表達譜，探討miRNA在著床前胚胎發(fā)育中的作用和意義。
　　方法：
　　1.運用腹腔注射孕馬血清及人絨毛膜促性腺激素誘導超排卵的方法收集小鼠囊胚。
　　2.采用miRNA芯片技術篩查小鼠囊胚發(fā)育階段miRNA的表達譜。
　　3.RT-PCR方法驗證芯片得

4、到的小鼠囊胚發(fā)育階段miRNA表達的結果。
　　結果：
　　1.共收集小鼠囊胚6000多個，獲取TotalRNA總量5μg；取2μgTotalRNA用于miRNA芯片雜交。用miRNA芯片技術，以芯片上熒光背景值2倍以上即熒光值大于600作為篩查標準，在小鼠囊胚發(fā)育階段共篩查到124個miRNA，其中有81個miRNA是在小鼠的著床后胚胎組織發(fā)現(xiàn)的，其中包括現(xiàn)已證實與發(fā)育和細胞分化相關的miRNAlet-7e、miR-125

5、a和miR-181a。另有43個miRNA是目前通過生物信息學分析預測其可能存在于小鼠中但尚未得到確認。
　　2.采用RT-PCR方法進一步確認let-7e和miR-125a（與線蟲lin4同源）在囊胚中的表達，取RT-PCR產(chǎn)物5μl經(jīng)12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，let-7e和miR-125a特異擴增產(chǎn)物、陽性對照人心臟miR-24擴增產(chǎn)物及內參照U6的擴增產(chǎn)物大小均在90bp左右；陰性對照為無RT產(chǎn)物有PCR引物，電泳可見有60

6、-70bp引物二聚體條帶結果。根據(jù)電泳結果表明let-7e和miR-125a均在囊胚表達，與芯片結果一致。
　　結論：研究發(fā)現(xiàn)miRNA在動物著床后胚胎發(fā)育的各個階段都有表達，并可能對胚胎發(fā)育有影響，但現(xiàn)在關于miRNA在著床前胚胎中的表達及其功能文獻報道還很少。本實驗采用miRNA芯片技術，大規(guī)模、高通量、快速而有效檢測miRNA表達譜，并結合靈敏度較高的RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)在小鼠囊胚發(fā)育階段表達大量的miRNA。其中包括了幾