病原微生物的基于熔解曲線的最小化多位點(diǎn)序列分型.pdf

1、病原微生物引起的傳染性疾病是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻課題。通過(guò)病原微生物分型，可實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物的流行病學(xué)調(diào)查、跟蹤和阻斷傳播途徑以遏制其暴發(fā)流行。理想的病原微生物分子分型技術(shù)，應(yīng)具有分型能力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確快速、高通量自動(dòng)化、成本低廉的特點(diǎn)。本論文以沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為模型，建立了一種新型的數(shù)字化病原微生物分子分型技術(shù)-基于熔解曲線的最小化多位點(diǎn)序列分型(minim McMLST)。
　　第一章，闡述了病原微

2、生物分型的意義。探討了目前病原微生物分型技術(shù)的研究現(xiàn)狀，重點(diǎn)介紹和比較了各種核酸指紋分型技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)了一個(gè)理想分型技術(shù)應(yīng)具備的特點(diǎn)。最后，在多位點(diǎn)序列分型技術(shù)(MLST)和多色熔解曲線分析(MMCA)的基礎(chǔ)上，提出了minim McMLST方法，本方法可利用MLST序列型(STs)中最少的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)達(dá)到病原微生物分型的目的。
　　第二章，首先詳細(xì)的闡述了minim McMLST方法的分型原理。然后以沙門氏

3、菌為模型，對(duì)minim McMLST技術(shù)的可行性進(jìn)行了初步的研究，建立了雙反應(yīng)三重?zé)晒釶CR的沙門氏菌分型體系。利用Minimum SNPs軟件對(duì)1560個(gè)STs進(jìn)行分析，共篩選出6個(gè)具有顯著分型能力的SNPs位點(diǎn)，另外，人工添加了1個(gè)SNP位點(diǎn)，用于區(qū)分中國(guó)最流行的兩種STs。理論上，這7個(gè)位點(diǎn)可將1560個(gè)STs分成了59種熔解類型(MTs)。本體系的特異性高，重復(fù)性好，檢測(cè)下限可達(dá)到5copies/反應(yīng)。對(duì)167份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，共

4、發(fā)現(xiàn)17種MTs。測(cè)序驗(yàn)證了52份代表菌株，分析顯示，探針覆蓋區(qū)與測(cè)序結(jié)果完全一致。利用PHYLIP軟件的非加權(quán)組平均法(UPGMA)對(duì)52份標(biāo)本構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，直觀顯示出，本方法獲得了17種MTs，而MLST方法獲得了23種STs。相對(duì)于MLST方法，計(jì)算出本方法的Simpson's index of diversity(D)等于0.9818。
　　第三章，在上述基礎(chǔ)上通過(guò)進(jìn)一步增加SNPs位點(diǎn)的選擇，探討提高minim Mc

5、MLST分辨率的途徑。我們以金黃色葡萄球菌為模型，建立了三管三重的金黃色葡萄球菌分型體系。該體系所檢測(cè)的SNPs位點(diǎn)增至15個(gè)，理論上可將2151個(gè)序列型分成288種MTs。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了376份標(biāo)本，獲得29種MTs。測(cè)序驗(yàn)證的70份代表菌株顯示，探針覆蓋區(qū)與測(cè)序結(jié)果完全一致。利用PHYLIP的UPGMA算法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，本方法獲得了24種MTs，而MLST方法獲得了29種STs。相對(duì)于MLST方法，計(jì)算出D值為0.9884