CD137分子通過微小RNA-145A-5p調(diào)控ApoE---小鼠活化T細胞核因子C1表達.pdf

1、動脈粥樣硬化是一種由炎癥、固有免疫以及脂質(zhì)浸潤等多種因素引起的慢性炎癥反應，能夠引起包括冠狀動脈、外周動脈在內(nèi)的多種血管病變，嚴重危害人類健康。微小RNA是一類長度約19～25 nt的單鏈非編碼RNA分子，主要通過在轉錄后水平調(diào)控目標基因表達參與生物的發(fā)展以及組織、器官的形成。其中，miR-145在維持平滑肌功能以及AS的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。CD137作為腫瘤壞死因子受體家族中的一員，主要表達在T細胞表面，通過與其配體CD137L

2、結合，激活后引起下游一系列免疫、炎癥反應。最新研究表明，CD137在AS的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作。NFATc1是一類重要的核轉錄因子，參與了炎癥、心臟瓣膜形成、T細胞激活以及破骨細胞生成等多種生物進程。我們前期實驗顯示，刺激CD137-CD137L軸能夠促進ApoE-/-小鼠斑塊的形成，誘導斑塊中淋巴細胞的激活和增殖，并促使NFATc1表達增加;在前期實驗中，我們發(fā)現(xiàn)應用刺激性CD137抗體刺激淋巴細胞后，NFATc1表達顯著增高，證實

3、NFATc1是CD137信號通路的下游分子。然而，CD137分子信號如何調(diào)控NFATc1尚不清楚，是否存在中間環(huán)節(jié)有待進一步闡明。生物信息學分析顯示NFATc1可能是miR-145a-5p的下游靶點，而自身免疫疾病大鼠模型中CD4+T細胞中過表達miR-145能明顯抑制NFATc1表達，提示:miR-145是NFATc1的上游分子。然而，CD137是否通過miR-145調(diào)節(jié)NFATc1的表達而影響AS的形成目前尚不清楚。因此，本實驗擬從

4、以下幾方面探討CD137分子信號是否通過miR-145調(diào)控NFATc1的表達。
　　研究目的:
　　1.體內(nèi)、外用CD137抗體激活CD137軸后，檢測miR-145及NFATc1水平改變。
　　2.檢測miR-145水平變化對NFATc1表達的影響。
　　3.初步探索CD137、miR-145以及NFATc1在平滑肌細胞中對細胞增殖、遷移的作用
　　4.ApoE-/-小鼠中，體外上調(diào)miR-145水平后觀

5、察斑塊的改變。
　　研究方法:
　　1.體內(nèi)、外用CD137抗體激活CD137軸后，檢測miR-145及NFATc1水平改變。
　　1.1體內(nèi)激活CD137軸，檢測ApoE-/-小鼠頸動脈miR-145及NFATc1水平改變
　　8周雄性ApoE-/-小鼠頸動脈置管后腹腔注射CD137激活型抗體，4周后取頸動脈提蛋白，Western Blot檢測NFATc1蛋白水平;提RNA，PCR檢測NFATc1mRNA及mi

6、R-145表達水平。免疫熒光檢測NFATc1分布。
　　1.2 CD137抗體刺激平滑肌細胞后，檢測miR-145及NFATc1水平改變
　　原代培養(yǎng)平滑肌細胞，TNF-α(10ng/ml)預處理24h后，CD137抗體（10μg/ml）刺激細胞24h;提蛋白，Western Blot檢測NFATc1蛋白水平;提RNA，PCR檢測NFATc1 mRNA及miR-145表達水平。
　　2.檢測miR-145水平變化對NF

7、ATc1表達的影響。
　　2.1分析miR-145對NFATc1的作用靶點
　　通過靶基因預測軟件targetscan以及pictar分析miR-145有可能發(fā)揮作用的靶點，構建含有/不含有相應靶點3' UTR區(qū)的真核表達質(zhì)粒，與microRNA mimic轉染細胞后，分析相應外源蛋白變化，初步驗證miR-145的作用靶點。
　　2.2 miR-145對CD137/NFATc1軸的影響
　　將miR-145 mi

8、mic或inhibitor轉入平滑肌細胞，分別以抗體激活/阻斷CD137軸，24h后q-PCR檢測NFATc1 mRNA水平，Western blot檢測NFATc1蛋白表達變化。
　　2.3分子克隆構建雙熒光素酶報告基因載體
　　將NFATc1含有靶點區(qū)域的3'UTR段通過PCR擴增后，經(jīng)酶切連接構建入psicheck-2質(zhì)粒。通過點突變試劑盒對psicheck-2質(zhì)粒目標靶點核心區(qū)域進行突變后，將野生型質(zhì)粒，突變質(zhì)粒與m

9、iR-145mimic或mimic control共轉染至293T細胞，48h后檢測其熒光表達水平。
　　3.初步探索CD137、miR-145以及NFATc1在平滑肌細胞中對細胞增殖、遷移的作用
　　3.1慢病毒介導NFATc1基因長期沉默的細胞株，miR-145過表達細胞株及對照細胞株的構建
　　利用慢病毒轉基因技術，構建沉默NFATc1、過表達miR-145及對照組的慢病毒質(zhì)粒，并命名為PLKO.1-shNFAT

10、c1、PLKO.1-miR-145、PLKO.1-Con使它和包裝質(zhì)粒一起共轉染293T細胞，生產(chǎn)病毒，轉染平滑肌細胞，嘌呤霉素篩選并克隆式培養(yǎng)穩(wěn)轉細胞株。Q-PCR分別檢測沉默細胞株及過表達細胞株中NFATc1或miR-145的表達。
　　3.2長期沉默NFATc1或過表達miR-145對CD137刺激引起的細胞功能影響
　　TNF-α(10ng/ml)預處理24h后，CD137抗體（10μg/ml）刺激細胞24h，CCK

11、8法檢測細胞增殖能力的變化，劃痕實驗及transwell實驗檢測細胞遷移能力的變化。
　　4.ApoE-/-小鼠中，體外上調(diào)miR-145水平后觀察斑塊的改變
　　4.18周ApoE-/-小鼠除CD137抗體刺激外，皮下注射miR-145agomir(10mg/kg/week)。3個月后取腹主動脈，測定斑塊及炎癥相關指標。
　　研究結果:
　　1.動物實驗及細胞實驗中，CD137軸激活可引起miR-145和靶基因

12、NFATc1的表達改變，且miR-145與NFATc1趨勢相反。
　　1.1 CD137抗體刺激的ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊中，miR-145顯著降低，NFATc1mRNA水平及蛋白水平升高。同時注射CD137阻斷型抗體則可逆轉該現(xiàn)象。
　　1.2 CD137抗體刺平滑肌細胞中，miR-145表達降低，NFATc1蛋白水平升高。抑制CD137可出現(xiàn)相反趨勢。
　　2.miR-145通過作用于NFATc1的3'UTR來

13、抑制NFATc1的表達
　　2.1 miR-145可與NFATc1的3'UTR相互作用
　　經(jīng)軟件預測分析發(fā)現(xiàn)，NFATc13'UTR的362-368可能是miR-145的結合位點。因此，我們構建了含有該作用位點以及不含有作用為點的NFATc1過表達載體。miR-145 mimics和質(zhì)粒共轉染實驗證實了miR-145確實可作用于NFATc1的3'UTR，從而抑制NFATc1的表達。
　　2.2 CD137通過miR-

14、145調(diào)控NFATc1表達
　　為了驗證miR-145是否是CD137/NFATc1通路的中間環(huán)節(jié)，我們在平滑肌細胞轉染mimic上調(diào)miR-145表達后，給予CD137抗體刺激;拮抗CD137同時，轉染inhibitor下調(diào)miR-145。結果表明，CD137對NFATc1的調(diào)控，可能是通過miR-145進行的。
　　2.3體外驗證miR-145可作用于NFATc1靶點
　　含有miR-145作用靶點的雙熒光素酶報告

15、基因質(zhì)粒，熒光活性可明顯被mimic抑制。然而將靶點的核心區(qū)域處進行點突變后，熒光活性則不受mimic影響。體外驗證了miR-145在NFATc1上靶點的有效性。
　　3.CD137能通過miR-145及NFATc1促進平滑肌細胞的增殖、遷移
　　3.1慢病毒介導NFATc1基因長期沉默與miR-145過表達的細胞株及對照細胞株的構建
　　成功包裝出具有感染力的病毒，并通過嘌呤霉素篩選獲得PLKO.1-shNFATc1

16、、PLKO.1-miR-145、PLKO.1-Con穩(wěn)轉細胞株，Q-PCR鑒定其效果。
　　3.2過表達miR-145或沉默NFATc1能夠抑制CD137對平滑肌細胞增殖、遷移的促進作用
　　PLKO.1-Con細胞株在CD137刺激下，增殖、遷移能力增強，而PLKO.1-shNFATc1、PLKO.1-miR-145細胞株CD137刺激下未見明顯細胞功能改變。
　　4.ApoE-/-小鼠中過表達miR-145能減輕C

17、D137軸激活引起的血管斑塊
　　4.1 miR-145能抑制斑塊形成
　　腹主動脈切片染色顯示，miR-145過表達的血管中，斑塊面積明顯減少，纖維帽明顯增厚，并且巨噬細胞聚集也較對照組減少。
　　4.2 miR-145能減少斑塊中炎癥相關分子表達
　　q-PCR顯示，miR-145過表達的小鼠腹主動脈血管中，炎癥相關因子如NFATc1、MMP-2、IL-2等mRNA水平顯著降低。
　　研究結論:

18、　　1.CD137軸激活能夠在體內(nèi)、外下調(diào)miR-145表達水平，并且上調(diào)miR-145靶基因NFATc1的表達。
　　2.通過軟件預測和構建一系列含有或不含有靶點位置的質(zhì)粒，從分子水平證明miR-145通過與NFATc1的3'UTR相互作用，從而抑制其蛋白的表達。
　　3.CD137軸激活能夠促進平滑肌細胞的增殖、遷移能力，并且增殖、遷移能力與miR-145及NFATc1的有關。
　　4.動物實驗表明，miR-145