CD137分子通過微小RNA-145A-5p調(diào)控ApoE---小鼠活化T細(xì)胞核因子C1表達(dá).pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是一種由炎癥、固有免疫以及脂質(zhì)浸潤等多種因素引起的慢性炎癥反應(yīng)，能夠引起包括冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈在內(nèi)的多種血管病變，嚴(yán)重危害人類健康。微小RNA是一類長度約19～25 nt的單鏈非編碼RNA分子，主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)參與生物的發(fā)展以及組織、器官的形成。其中，miR-145在維持平滑肌功能以及AS的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。CD137作為腫瘤壞死因子受體家族中的一員，主要表達(dá)在T細(xì)胞表面，通過與其配體CD137L

2、結(jié)合，激活后引起下游一系列免疫、炎癥反應(yīng)。最新研究表明，CD137在AS的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作。NFATc1是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與了炎癥、心臟瓣膜形成、T細(xì)胞激活以及破骨細(xì)胞生成等多種生物進(jìn)程。我們前期實(shí)驗(yàn)顯示，刺激CD137-CD137L軸能夠促進(jìn)ApoE-/-小鼠斑塊的形成，誘導(dǎo)斑塊中淋巴細(xì)胞的激活和增殖，并促使NFATc1表達(dá)增加;在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用刺激性CD137抗體刺激淋巴細(xì)胞后，NFATc1表達(dá)顯著增高，證實(shí)

3、NFATc1是CD137信號(hào)通路的下游分子。然而，CD137分子信號(hào)如何調(diào)控NFATc1尚不清楚，是否存在中間環(huán)節(jié)有待進(jìn)一步闡明。生物信息學(xué)分析顯示NFATc1可能是miR-145a-5p的下游靶點(diǎn)，而自身免疫疾病大鼠模型中CD4+T細(xì)胞中過表達(dá)miR-145能明顯抑制NFATc1表達(dá)，提示:miR-145是NFATc1的上游分子。然而，CD137是否通過miR-145調(diào)節(jié)NFATc1的表達(dá)而影響AS的形成目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬從

4、以下幾方面探討CD137分子信號(hào)是否通過miR-145調(diào)控NFATc1的表達(dá)。
　　研究目的:
　　1.體內(nèi)、外用CD137抗體激活CD137軸后，檢測miR-145及NFATc1水平改變。
　　2.檢測miR-145水平變化對NFATc1表達(dá)的影響。
　　3.初步探索CD137、miR-145以及NFATc1在平滑肌細(xì)胞中對細(xì)胞增殖、遷移的作用
　　4.ApoE-/-小鼠中，體外上調(diào)miR-145水平后觀

5、察斑塊的改變。
　　研究方法:
　　1.體內(nèi)、外用CD137抗體激活CD137軸后，檢測miR-145及NFATc1水平改變。
　　1.1體內(nèi)激活CD137軸，檢測ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈miR-145及NFATc1水平改變
　　8周雄性ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈置管后腹腔注射CD137激活型抗體，4周后取頸動(dòng)脈提蛋白，Western Blot檢測NFATc1蛋白水平;提RNA，PCR檢測NFATc1mRNA及mi

6、R-145表達(dá)水平。免疫熒光檢測NFATc1分布。
　　1.2 CD137抗體刺激平滑肌細(xì)胞后，檢測miR-145及NFATc1水平改變
　　原代培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，TNF-α(10ng/ml)預(yù)處理24h后，CD137抗體（10μg/ml）刺激細(xì)胞24h;提蛋白，Western Blot檢測NFATc1蛋白水平;提RNA，PCR檢測NFATc1 mRNA及miR-145表達(dá)水平。
　　2.檢測miR-145水平變化對NF

7、ATc1表達(dá)的影響。
　　2.1分析miR-145對NFATc1的作用靶點(diǎn)
　　通過靶基因預(yù)測軟件targetscan以及pictar分析miR-145有可能發(fā)揮作用的靶點(diǎn)，構(gòu)建含有/不含有相應(yīng)靶點(diǎn)3' UTR區(qū)的真核表達(dá)質(zhì)粒，與microRNA mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，分析相應(yīng)外源蛋白變化，初步驗(yàn)證miR-145的作用靶點(diǎn)。
　　2.2 miR-145對CD137/NFATc1軸的影響
　　將miR-145 mi

8、mic或inhibitor轉(zhuǎn)入平滑肌細(xì)胞，分別以抗體激活/阻斷CD137軸，24h后q-PCR檢測NFATc1 mRNA水平，Western blot檢測NFATc1蛋白表達(dá)變化。
　　2.3分子克隆構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體
　　將NFATc1含有靶點(diǎn)區(qū)域的3'UTR段通過PCR擴(kuò)增后，經(jīng)酶切連接構(gòu)建入psicheck-2質(zhì)粒。通過點(diǎn)突變試劑盒對psicheck-2質(zhì)粒目標(biāo)靶點(diǎn)核心區(qū)域進(jìn)行突變后，將野生型質(zhì)粒，突變質(zhì)粒與m

9、iR-145mimic或mimic control共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，48h后檢測其熒光表達(dá)水平。
　　3.初步探索CD137、miR-145以及NFATc1在平滑肌細(xì)胞中對細(xì)胞增殖、遷移的作用
　　3.1慢病毒介導(dǎo)NFATc1基因長期沉默的細(xì)胞株，miR-145過表達(dá)細(xì)胞株及對照細(xì)胞株的構(gòu)建
　　利用慢病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建沉默NFATc1、過表達(dá)miR-145及對照組的慢病毒質(zhì)粒，并命名為PLKO.1-shNFAT

10、c1、PLKO.1-miR-145、PLKO.1-Con使它和包裝質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，生產(chǎn)病毒，轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞，嘌呤霉素篩選并克隆式培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。Q-PCR分別檢測沉默細(xì)胞株及過表達(dá)細(xì)胞株中NFATc1或miR-145的表達(dá)。
　　3.2長期沉默NFATc1或過表達(dá)miR-145對CD137刺激引起的細(xì)胞功能影響
　　TNF-α(10ng/ml)預(yù)處理24h后，CD137抗體（10μg/ml）刺激細(xì)胞24h，CCK

11、8法檢測細(xì)胞增殖能力的變化，劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化。
　　4.ApoE-/-小鼠中，體外上調(diào)miR-145水平后觀察斑塊的改變
　　4.18周ApoE-/-小鼠除CD137抗體刺激外，皮下注射miR-145agomir(10mg/kg/week)。3個(gè)月后取腹主動(dòng)脈，測定斑塊及炎癥相關(guān)指標(biāo)。
　　研究結(jié)果:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，CD137軸激活可引起miR-145和靶基因

12、NFATc1的表達(dá)改變，且miR-145與NFATc1趨勢相反。
　　1.1 CD137抗體刺激的ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈斑塊中，miR-145顯著降低，NFATc1mRNA水平及蛋白水平升高。同時(shí)注射CD137阻斷型抗體則可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。
　　1.2 CD137抗體刺平滑肌細(xì)胞中，miR-145表達(dá)降低，NFATc1蛋白水平升高。抑制CD137可出現(xiàn)相反趨勢。
　　2.miR-145通過作用于NFATc1的3'UTR來

13、抑制NFATc1的表達(dá)
　　2.1 miR-145可與NFATc1的3'UTR相互作用
　　經(jīng)軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，NFATc13'UTR的362-368可能是miR-145的結(jié)合位點(diǎn)。因此，我們構(gòu)建了含有該作用位點(diǎn)以及不含有作用為點(diǎn)的NFATc1過表達(dá)載體。miR-145 mimics和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-145確實(shí)可作用于NFATc1的3'UTR，從而抑制NFATc1的表達(dá)。
　　2.2 CD137通過miR-

14、145調(diào)控NFATc1表達(dá)
　　為了驗(yàn)證miR-145是否是CD137/NFATc1通路的中間環(huán)節(jié)，我們在平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic上調(diào)miR-145表達(dá)后，給予CD137抗體刺激;拮抗CD137同時(shí)，轉(zhuǎn)染inhibitor下調(diào)miR-145。結(jié)果表明，CD137對NFATc1的調(diào)控，可能是通過miR-145進(jìn)行的。
　　2.3體外驗(yàn)證miR-145可作用于NFATc1靶點(diǎn)
　　含有miR-145作用靶點(diǎn)的雙熒光素酶報(bào)告

15、基因質(zhì)粒，熒光活性可明顯被mimic抑制。然而將靶點(diǎn)的核心區(qū)域處進(jìn)行點(diǎn)突變后，熒光活性則不受mimic影響。體外驗(yàn)證了miR-145在NFATc1上靶點(diǎn)的有效性。
　　3.CD137能通過miR-145及NFATc1促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移
　　3.1慢病毒介導(dǎo)NFATc1基因長期沉默與miR-145過表達(dá)的細(xì)胞株及對照細(xì)胞株的構(gòu)建
　　成功包裝出具有感染力的病毒，并通過嘌呤霉素篩選獲得PLKO.1-shNFATc1

16、、PLKO.1-miR-145、PLKO.1-Con穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，Q-PCR鑒定其效果。
　　3.2過表達(dá)miR-145或沉默NFATc1能夠抑制CD137對平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的促進(jìn)作用
　　PLKO.1-Con細(xì)胞株在CD137刺激下，增殖、遷移能力增強(qiáng)，而PLKO.1-shNFATc1、PLKO.1-miR-145細(xì)胞株CD137刺激下未見明顯細(xì)胞功能改變。
　　4.ApoE-/-小鼠中過表達(dá)miR-145能減輕C

17、D137軸激活引起的血管斑塊
　　4.1 miR-145能抑制斑塊形成
　　腹主動(dòng)脈切片染色顯示，miR-145過表達(dá)的血管中，斑塊面積明顯減少，纖維帽明顯增厚，并且巨噬細(xì)胞聚集也較對照組減少。
　　4.2 miR-145能減少斑塊中炎癥相關(guān)分子表達(dá)
　　q-PCR顯示，miR-145過表達(dá)的小鼠腹主動(dòng)脈血管中，炎癥相關(guān)因子如NFATc1、MMP-2、IL-2等mRNA水平顯著降低。
　　研究結(jié)論:

18、　　1.CD137軸激活能夠在體內(nèi)、外下調(diào)miR-145表達(dá)水平，并且上調(diào)miR-145靶基因NFATc1的表達(dá)。
　　2.通過軟件預(yù)測和構(gòu)建一系列含有或不含有靶點(diǎn)位置的質(zhì)粒，從分子水平證明miR-145通過與NFATc1的3'UTR相互作用，從而抑制其蛋白的表達(dá)。
　　3.CD137軸激活能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移能力，并且增殖、遷移能力與miR-145及NFATc1的有關(guān)。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，miR-145