CD137信號(hào)通過(guò)Smad1-5-NFATc1信號(hào)調(diào)控血管新生.pdf

1、目的：
　　CD137信號(hào)是否通過(guò)Smad1/5調(diào)節(jié)活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFATc1）信號(hào)調(diào)控血管新生。
　　方法：
　　1.小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型：使用載脂蛋白E基因敲除(ApoE)-/-小鼠建立小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。
　　2.馬松染色與免疫組化染色：分別使用馬松及免疫組化染色方法觀察干預(yù)CD137軸后斑塊變化（斑塊面積，組成，NFATc1，C

2、D31，CD68）。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytomery，F(xiàn)CM）：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)CD137膜蛋白表達(dá)水平。
　　4. Western blot技術(shù)：檢測(cè)p-Smad1/5，Smad1/5總蛋白，NFATc1核蛋白及總蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)NFATc1在內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)外分布。
　　5.增殖和遷移實(shí)驗(yàn)：CCK8檢測(cè)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。

3、r>　　6.體內(nèi)外血管新生模型：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）管腔形成實(shí)驗(yàn)，小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)分別作為體外，離體，體內(nèi)血管新生模型檢測(cè)CD137對(duì)血管新生的影響。
　　7.分子生物學(xué)方法：轉(zhuǎn)染Smad1/5小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾Smad1/5基因表達(dá)。構(gòu)建沉默NFATc1基因及其

4、對(duì)照的慢病毒載體，慢病毒包裝，感染細(xì)胞，篩選細(xì)胞系，分別命名為PLKO.1-shNFATc1和PLKO.1-shGFP。
　　結(jié)果：
　　1. CD137可誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)NFATc1及CD31表達(dá)。
　　2.腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（10ng/ml）刺激HUVEC和小鼠腦微血管EC24h后,CD137膜蛋白表達(dá)增加。
　　3. CD1

5、37促進(jìn)體內(nèi)外血管新生：內(nèi)皮細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到，相較對(duì)照組而言，在添加刺激性CD137抗體（CD137 mAb，5mg/L）條件下，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)（p均<0.05），而CD137阻斷性抗體（anti-CD137，5mg/L）可阻斷該現(xiàn)象。同時(shí)，CD137刺激條件下，體外HUVEC管腔形成實(shí)驗(yàn)顯示，小管總長(zhǎng)度及分支點(diǎn)數(shù)目顯著增加（p均<0.05）；離體主動(dòng)脈環(huán)血管新生實(shí)驗(yàn)顯示，動(dòng)脈環(huán)微血管數(shù)目顯著增加（p均<0.0

6、5）；而在基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)中，可觀察到單獨(dú)CD137刺激條件下，雖然未觀察到明顯血管新生現(xiàn)象，但CD137可增強(qiáng)VEGF誘導(dǎo)的血管新生作用（膠內(nèi)紅色表示紅細(xì)胞），血紅蛋白含量明顯增加（p<0.05）。在三種血管新生模型中，CD137所誘導(dǎo)的促進(jìn)作用均可被anti-CD137所抑制。
　　4. CD137激活內(nèi)皮細(xì)胞Smad1/5蛋白及上調(diào)NFATc1蛋白表達(dá)并轉(zhuǎn)位入核：CD137抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)磷酸化Smad1/5（p-Sm

7、ad1/5）蛋白及NFATc1蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高，分別于1h及12h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比差異顯著，且這種活化作用可被抑制性CD137抗體所阻斷（p均<0.05）。激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)CD137信號(hào)，細(xì)胞核內(nèi)NFATc1蛋白表達(dá)水平升高（p<0.05），與western blot檢測(cè)結(jié)果一致，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示:與對(duì)照組相比，添加CD137抗體不僅可增加NFATc1蛋白表達(dá)，并促進(jìn)NFATc1進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)添加抑制性CD137

8、抗體可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。
　　5. Smad1/5 siRNA可減弱CD137誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)NFATc1及促進(jìn)體外血管新生的效應(yīng)：轉(zhuǎn)染Smad1/5 siRNA沉默Smad1/5基因表達(dá)后，再添加刺激性CD137抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞顯示，p-Smad1/5活化受到抑制，不僅NFATc1總蛋白及核蛋白表達(dá)水平下降（p均<0.05），而且HUVEC管腔實(shí)驗(yàn)及動(dòng)脈環(huán)血管新生實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，小管長(zhǎng)度及分支顯著減少，動(dòng)脈環(huán)內(nèi)微血管形成數(shù)量減

9、少（p均<0.05）。
　　6.沉默NFATc1基因可減弱體外CD137誘導(dǎo)血管新生效應(yīng)：HUVEC管腔形成實(shí)驗(yàn)中，添加CD137刺激后，相較對(duì)照細(xì)胞系PLKO.1-shGFP，沉默NFATc1的內(nèi)皮細(xì)胞系PLKO.1-shNFATc1小管長(zhǎng)度及分支點(diǎn)顯著減少（p均<0.05）。在離體主動(dòng)脈環(huán)血管新生實(shí)驗(yàn)中，沉默NFATc1基因后，添加CD137刺激，小鼠主動(dòng)脈環(huán)形成的微血管數(shù)量較對(duì)照組明顯減少（p<0.05）。
　　結(jié)論：