CD137信號通過Smad1-5-NFATc1信號調(diào)控血管新生.pdf

1、目的：
　　CD137信號是否通過Smad1/5調(diào)節(jié)活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFATc1）信號調(diào)控血管新生。
　　方法：
　　1.小鼠動脈粥樣硬化模型：使用載脂蛋白E基因敲除(ApoE)-/-小鼠建立小鼠動脈粥樣硬化模型。
　　2.馬松染色與免疫組化染色：分別使用馬松及免疫組化染色方法觀察干預CD137軸后斑塊變化（斑塊面積，組成，NFATc1，C

2、D31，CD68）。
　　3.流式細胞術(shù)（Flow Cytomery，F(xiàn)CM）：流式細胞術(shù)檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)CD137膜蛋白表達水平。
　　4. Western blot技術(shù)：檢測p-Smad1/5，Smad1/5總蛋白，NFATc1核蛋白及總蛋白表達水平。細胞免疫熒光法檢測NFATc1在內(nèi)皮細胞細胞核內(nèi)外分布。
　　5.增殖和遷移實驗：CCK8檢測檢測內(nèi)皮細胞增殖情況，Transwell遷移實驗檢測內(nèi)皮細胞遷移能力。

3、r>　　6.體內(nèi)外血管新生模型：人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）管腔形成實驗，小鼠主動脈環(huán)血管新生實驗，體內(nèi)基質(zhì)膠塞實驗分別作為體外，離體，體內(nèi)血管新生模型檢測CD137對血管新生的影響。
　　7.分子生物學方法：轉(zhuǎn)染Smad1/5小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾Smad1/5基因表達。構(gòu)建沉默NFATc1基因及其

4、對照的慢病毒載體，慢病毒包裝，感染細胞，篩選細胞系，分別命名為PLKO.1-shNFATc1和PLKO.1-shGFP。
　　結(jié)果：
　　1. CD137可誘導ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)NFATc1及CD31表達。
　　2.腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（10ng/ml）刺激HUVEC和小鼠腦微血管EC24h后,CD137膜蛋白表達增加。
　　3. CD1

5、37促進體內(nèi)外血管新生：內(nèi)皮細胞功能實驗中，我們觀察到，相較對照組而言，在添加刺激性CD137抗體（CD137 mAb，5mg/L）條件下，小鼠內(nèi)皮細胞增殖和遷移能力增強（p均<0.05），而CD137阻斷性抗體（anti-CD137，5mg/L）可阻斷該現(xiàn)象。同時，CD137刺激條件下，體外HUVEC管腔形成實驗顯示，小管總長度及分支點數(shù)目顯著增加（p均<0.05）；離體主動脈環(huán)血管新生實驗顯示，動脈環(huán)微血管數(shù)目顯著增加（p均<0.0

6、5）；而在基質(zhì)膠塞實驗中，可觀察到單獨CD137刺激條件下，雖然未觀察到明顯血管新生現(xiàn)象，但CD137可增強VEGF誘導的血管新生作用（膠內(nèi)紅色表示紅細胞），血紅蛋白含量明顯增加（p<0.05）。在三種血管新生模型中，CD137所誘導的促進作用均可被anti-CD137所抑制。
　　4. CD137激活內(nèi)皮細胞Smad1/5蛋白及上調(diào)NFATc1蛋白表達并轉(zhuǎn)位入核：CD137抗體刺激內(nèi)皮細胞后，細胞內(nèi)磷酸化Smad1/5（p-Sm

7、ad1/5）蛋白及NFATc1蛋白表達呈時間依賴性升高，分別于1h及12h時表達水平達到峰值，與對照組相比差異顯著，且這種活化作用可被抑制性CD137抗體所阻斷（p均<0.05）。激活內(nèi)皮細胞內(nèi)CD137信號，細胞核內(nèi)NFATc1蛋白表達水平升高（p<0.05），與western blot檢測結(jié)果一致，免疫熒光實驗顯示:與對照組相比，添加CD137抗體不僅可增加NFATc1蛋白表達，并促進NFATc1進入細胞核，同時添加抑制性CD137

8、抗體可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。
　　5. Smad1/5 siRNA可減弱CD137誘導內(nèi)皮細胞表達NFATc1及促進體外血管新生的效應(yīng)：轉(zhuǎn)染Smad1/5 siRNA沉默Smad1/5基因表達后，再添加刺激性CD137抗體刺激內(nèi)皮細胞顯示，p-Smad1/5活化受到抑制，不僅NFATc1總蛋白及核蛋白表達水平下降（p均<0.05），而且HUVEC管腔實驗及動脈環(huán)血管新生實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，小管長度及分支顯著減少，動脈環(huán)內(nèi)微血管形成數(shù)量減

9、少（p均<0.05）。
　　6.沉默NFATc1基因可減弱體外CD137誘導血管新生效應(yīng)：HUVEC管腔形成實驗中，添加CD137刺激后，相較對照細胞系PLKO.1-shGFP，沉默NFATc1的內(nèi)皮細胞系PLKO.1-shNFATc1小管長度及分支點顯著減少（p均<0.05）。在離體主動脈環(huán)血管新生實驗中，沉默NFATc1基因后，添加CD137刺激，小鼠主動脈環(huán)形成的微血管數(shù)量較對照組明顯減少（p<0.05）。
　　結(jié)論：