漢族人群線粒體基因單倍型類群與重度膿毒血癥發(fā)病和預(yù)后的相關(guān)性研究.pdf

1、重度膿毒血癥是指膿毒血癥合并有器官功能障礙，與之相關(guān)的多器官功能障礙是目前重癥患者的最常見的死因。膿毒血癥導(dǎo)致多器官功能障礙的具體發(fā)病機(jī)制目前還不清楚，一般認(rèn)為有多種因素發(fā)揮了作用，如微循環(huán)障礙、氧代謝紊亂、凋亡異常、細(xì)胞因子和其他膿毒血癥相關(guān)因素的直接細(xì)胞毒作用等。近來，大量研究顯示，細(xì)胞間氧利用障礙，即所謂“Cytopathic hypoxia”，在重度膿毒血癥，特別是多器官功能障礙的發(fā)生過程中起了關(guān)鍵的作用。機(jī)體90％的氧是由線粒

2、體利用的，并產(chǎn)生最主要的能量供應(yīng)物質(zhì)三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，以維持細(xì)胞正常的生理需要和代謝平衡。電子在定位于線粒體內(nèi)膜上的一系列呼吸鏈復(fù)合體中傳遞，通過氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP。因此，線粒體的功能狀態(tài)很有可能是與重度膿毒血癥、特別是多器官功能障礙的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的。 線粒體為一“半自主”細(xì)胞器，含有自身的DNA物質(zhì)。線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)為雙鏈

3、環(huán)狀DNA，全長約16,000堿基對，它包含37個(gè)基因，其中2個(gè)為rRNA基因，22個(gè)為tRNA基因，13個(gè)為蛋白質(zhì)編碼基因，編碼線粒體呼吸鏈復(fù)合體上的一系列蛋白。人類mtDNA是嚴(yán)格母系遺傳的，并可根據(jù)其編碼區(qū)和控制區(qū)的一些特異性變異，將其分為不同的世系，即mtDNA單倍型類群。大量的研究表明，mtDNA單倍型類群是線粒體功能相關(guān)的，可影響線粒體呼吸鏈的活性，并與許多疾病如：帕金森綜合癥(Parkinson disease,PD)、老

4、年性癡呆(Alzheimer disease，AD)、乳腺癌、食管癌等的發(fā)病相關(guān)。最近又有學(xué)者報(bào)道了歐洲主要mtDNA單倍型類群H是重度膿毒血癥的獨(dú)立預(yù)后因素，發(fā)現(xiàn)屬于此種單倍型類群的患者，相較于非H型的個(gè)體具有更好的180天生存率(2.12倍)。雖然不同地域、種族、遺產(chǎn)背景的人群具有不同的mtDNA單倍型類群分布率，我們認(rèn)為在其他種族中也應(yīng)該存在類似重度膿毒血癥和mtDNA單倍型類群之間的相關(guān)性。這樣的研究，在歐洲和北美人群以外，目前

5、相關(guān)的報(bào)道非常少。漢族人群是世界上最大的族群，約占中國總?cè)丝诘?3％，世界總?cè)丝诘?0％。大部分的漢族人群mtDNA單被型類群可以歸入三個(gè)主要的mtDNA單倍型類群M、N、R(其本身為N型的分支，且為歐亞共同分支)。本研究中，我們通過建立快捷有效的mtDNA單倍型類群分型方法，檢測了570例健康漢族人和相同遺傳背景的181例重度膿毒血癥患者的mtDNA單倍型類群類型，并前瞻性的研究了mtDNA單倍型類群與重度膿毒血癥發(fā)病和預(yù)后的相關(guān)性。

6、 第一部分： 研究目的：建立快速、可靠、適用于大樣本量研究的mtDNA單倍型分型策略和檢測方法。 材料和方法：選擇浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院體檢中心健康志愿者70例。以線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)高變區(qū)序列分析結(jié)合編碼區(qū)特征性變異檢測驗(yàn)證的分型策略，特征性變異參照升級的東亞人群mtDNA單倍型類群分型樹。以PCR擴(kuò)增后測序分析作為高變區(qū)序列分析的檢測方法，編碼區(qū)特異性變異檢測則由

7、熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針在Real—time RCR AlleleDiscrimination-SNP’s模式下完成。對于以上述手段完成的mtDNA單倍型類群分型結(jié)果，用經(jīng)典的限制性片段長度多態(tài)性分析(Restriction fragment length po1ymorphism，RFLP)進(jìn)行驗(yàn)證比較。 結(jié)果：用mtDNA高變區(qū)I(hypervariable segment I，HVS I)序列分析結(jié)合編碼區(qū)特異性變異熒光標(biāo)記

8、寡核苷酸探針驗(yàn)證的方法，對70例健康志愿者進(jìn)行了mtDNA單倍型類群分型。對于分型結(jié)果屬于mtDNA單倍型類群A、D、M7和M9的樣本，用RFL，P對相應(yīng)特異性酶切位點(diǎn)進(jìn)行檢測，A樣本出現(xiàn)了特征性的2個(gè)DNA片段：290bp和257bp，D型樣本出現(xiàn)了特征性的2個(gè)DNA片段：312bp和284bp，M7型樣本出現(xiàn)了特征型的2個(gè)DNA片段：361bp和47bp，M7型樣本的限制性酶切片段中含有特征性的DNA片段：76bp和36bp。RFL

9、P mtDNA單倍型類群的分型結(jié)果與序列分析和寡核苷酸探針分型的結(jié)果完全一致。 結(jié)論：mtDNA HVSI序列分析結(jié)合編碼區(qū)特征性變異驗(yàn)證的分型策略是一兼顧敏感性和特異性的有效分型思路。熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針是檢測mtDNA編碼區(qū)特征性單核苷酸突變的簡捷方法，敏感性和特異性好，適用于大樣本研究。 第二部分： 研究目的：探討漢族人群主要mtDNA單倍型類群M、N、R與重度膿毒血癥的發(fā)病率之間的相關(guān)性。 材料

10、和方法：病例組來自2006年6月～11月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive care unit，ICU)，急診重癥監(jiān)護(hù)室(Emergency intensive care unit，EICU)就診并符合重度膿毒血癥診斷的181例患者。健康對照組選擇來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院體檢中心體檢的健康志愿者570例。采用mtDNA HVS I序列分析結(jié)合編碼區(qū)序列特征性變異驗(yàn)證的方法對研究對象的mtDNA單倍型類群進(jìn)行

11、確定。 結(jié)果：分型結(jié)果顯示：東亞人群主要mtDNA單倍型類群M、N、R在健康對照組的分布率分別為：47.7％、48.5％、37％，在重度膿毒血癥病例組中的分布率分別為：47％、50.8％、36.5％。X2分析的結(jié)果顯示，mtDNA單倍型類群在病例組和健康對照組中的分布率沒有明顯差異。在重度膿毒血癥病例組中，mtDNA單倍型類群R的患者，其入組第一天的最高體溫要明顯高于非R型的個(gè)體(37.88±0.129℃VS37.54±0.10

12、6℃，P=0.044)。 結(jié)論：漢族人群主要mtDNA單倍型類群M、N、R與重度膿血癥的發(fā)病率無明顯相關(guān)性。重度膿毒血癥急性期，mtDNA單倍型類群R的患者相較于非R的個(gè)體具有較高的體溫。 第三部分： 研究目的：分析漢族人群中mtDNA單倍型類群R與重度膿毒血癥預(yù)后的相關(guān)性。 材料和方法：病例組和健康對照組同第二部分。對患者進(jìn)行追蹤隨訪，記錄一般信息和基本臨床資料。進(jìn)行入組24小時(shí)的APACHE II(A

13、cute physiology and chronic health evaluation)評分和SOFA(Sepsis-related organ failure assessment)評分，之后每天進(jìn)行SOFA評分，自至患者死亡或生存至第180天。采用先單因素分析，再多因素分析的統(tǒng)計(jì)原則，對可能的影響預(yù)后的臨床指標(biāo)以及mtDNA單倍型類群與重度膿毒血癥患者的預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析，并以95％可信區(qū)間(Confidence interva

14、l，CI)的OR(Odds ratios)值來估計(jì)獨(dú)立變量與應(yīng)變量的相關(guān)性。 結(jié)果：對生存組與死亡組的臨床資料進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，相較與死亡組，生存組患者平均年齡較低，合并慢性疾病狀況少，入組24小時(shí)的APACFIE II評分和SOFA評分低，胸腔感染的發(fā)生率低。X2分析顯示，mtDNA單倍型類群R患者的180天生存率為68.2％，明顯高于其他mtDNA單倍型類群(p=0.006)。Kaplan-Meier生存分析顯示mtDNA單倍型

15、類群R患者180天生存預(yù)后要明顯高于非R型的患者(p=0.0063)。mtDNA單倍型類群R患者組的基本臨床狀況，如年齡、有無合并慢性疾病、感染部位、入組24小時(shí)的APACHEII評分和SOFA評分等，于非R型患者組相比，未發(fā)現(xiàn)明顯差異。選取平均年齡、慢性病合并情況、感染部位、入組24小時(shí)的APACHE II評分和SOFA評分和單倍型類群為變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析顯示mtDNA單倍型類群R是影響重度膿毒血癥患者預(yù)后的獨(dú)立

16、因素，提示較高的生存率(OR 4.543，95％CI 1.903-10.844，p=0.001)。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)在病例組中必需進(jìn)行輔助通氣的患者，單倍型類群為R的個(gè)體，其輔助通氣的最終脫機(jī)率要明顯高于非R型的個(gè)體(p=0.042)。多因素Logistic回歸分析mtDNA單倍型類群R是影響重度膿毒血癥患者輔助通氣脫機(jī)率的獨(dú)立因素，提示較高的脫機(jī)率(OR 9.315，95％CI 3.014-27.684，p<0.001)。 結(jié)論