PTPN22基因多態(tài)性與中國廣東漢族人群RA發(fā)病的相關(guān)性研究.pdf

1、本論文以中國廣東漢族RA人群為主要研究對象，采用高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）與DNA測序相結(jié)合及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析法與DNA測序相結(jié)合的檢測技術(shù)，研究中國廣東漢族

2、RA患者PTPN22-1123 G→C基因多態(tài)性與RA發(fā)病的相關(guān)性及PTPN221858 C→T SNP在中國廣東人群中的發(fā)生頻率，同時(shí)采用熒光定量PCR技術(shù)對PTPN22基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量，了解G-1123C SNP對RA患者PTPN22基因表達(dá)的影響，為探討RA的發(fā)病機(jī)制及臨床早期診斷提供實(shí)驗(yàn)室的理論依據(jù)。 研究方法： 1.研究對象; RA組為2007年3月～2008年12月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院就

3、診的門診無血緣關(guān)系RA病人，其診斷依據(jù)為美國大學(xué)1987年修訂的類風(fēng)濕學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。RA患者148人，男性27人，女性121人，其中湖南籍10人，江西4人，福建省3人，貴州1人、河南省1人，廣東129人。對照組為無血緣關(guān)系的同期醫(yī)院門診健康體檢者。男性41人，女性111人，廣東省152人。兩組均為漢族，排除其它自身免疫性疾病和嚴(yán)重心、肝、腎疾病。 2.研究方法; 2．1,酚-氯仿法抽提DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增目的

4、片段。 2．2,采用PCR-RFLP，結(jié)合DNA測序技術(shù)檢測PTPN22基因C1858T多態(tài)性。 2．3,采用DHPLC法，結(jié)合DNA測序技術(shù)檢測PTPN22基因G-1123C多態(tài)性。 運(yùn)用SPSS13．0進(jìn)行二分類的Logistic回歸分析，以所有個(gè)體是否發(fā)病為因變量Y，年齡、性別為自變量X進(jìn)行分析，觀察去除性別、年齡因素后各基因型與RA患者發(fā)病的相關(guān)性。根據(jù)RA病人X線檢查是否出現(xiàn)關(guān)節(jié)損傷、RF的陰陽性、發(fā)病

5、起始年齡的臨床特征，將RA患者分為六組，并與健康對照組分別進(jìn)行比較，分析G-1123C SNP位點(diǎn)的發(fā)生與各臨床特征之間的相關(guān)性。 2．4,收集148例RA患者，均為臨床確診病人，其中52名患者臨床特征資料完整齊全，按照RA患者-1123 SNP位點(diǎn)基因型的不同，將52名RA患者分為突變雜合子（GC型）RA組、突變純合子（CC型）RA組、以及野生型（GG型）RA組三個(gè)不同組別，分別對三組間RA患者的各個(gè)臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，觀察

6、三組不同基因型RA患者的臨床特征間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2．5,采用SYBR Green熒光染料定量PCR檢測所有突變病人組及健康對照組PTPN22基因的表達(dá)量，以GAPDH管家基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用△CT法計(jì)算，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察兩組樣本PTPN22基因的表達(dá)量是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以2-△△cr法計(jì)算兩組表達(dá)量的差別。 2．6,統(tǒng)計(jì)方法; 采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算PTPN22兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率和等

7、位基因頻率；各組間基因型和等位基因分布比較采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Pearson x2檢驗(yàn)；運(yùn)用二分類logistic回歸分析去除性別和年齡因素的影響，以了解各基因型與RA發(fā)病相關(guān)的OR值。攜帶C基因與RA臨床特征的相關(guān)性分析，以Pearson X2檢驗(yàn)逐一分析。以X±s表示樣本的均數(shù)，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，兩個(gè)獨(dú)立樣本率的比較采用X2，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用one-way ANOVA，多個(gè)樣本率的比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參

8、數(shù)檢驗(yàn)，定義雙側(cè)P<0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果: 1、PTPN22 G-1123C位點(diǎn)與中國廣東漢族人群RA的發(fā)病有關(guān)，RA病人組與對照組PTPN22 G-1123C SNP基因型的發(fā)生頻數(shù)存在差異（P=0．016）；兩組間攜帶C突變基因的頻數(shù)有顯著性差異（P=0．000； OR，1．837；95%CI，1．328～2．541）。logistic回歸分析進(jìn)一步提示：去除性別及年齡的影響因素后，兩組間基因型頻率仍存在差

9、異（P=0．021），其中突變雜合予GC型與RA的發(fā)病明顯相關(guān)（P=0．006； OR，2．051；95%CI，1．234～3．410）。 2、PTPN22基因C1858T多態(tài)性在中國廣東地區(qū)漢族人群中發(fā)生的頻率為0，C1858T SNP位點(diǎn)與中國廣東漢族人群RA的發(fā)病無關(guān)，所檢測的148例RA患者及151例健康對照組基因表型為CC野生型。 3、PIPN22-1123G>CSNP與RA患者類風(fēng)濕因子（RF）的產(chǎn)生有關(guān)，P

10、TPN22-1123G>CSNP基因分型與RF因子陽性RA患者相關(guān)P=0．041<0．05，而與RF因子陰性RA患者無關(guān)P=0．862>0．05。 4、比較三組不同基因型RA患者的臨床特征，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值均>0．05。 5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，突變病人組（包括突變雜合子及突變純合子型RA病人）PTPN22mRNA表達(dá)量是對照組（野生型健康對照組人員）的3．742倍，P=0．025<0．05，突變病人組外周

11、血白細(xì)胞PTPN22mRNA表達(dá)量升高。 結(jié)論: 1、PTPN22 G-1123C位點(diǎn)與中國廣東漢族人群RA的發(fā)病具有相關(guān)性，而PTPN22 C1858T SNP位點(diǎn)與中國廣東漢族人群RA的發(fā)病無關(guān)；提示PTPN22 G-1123C位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。突變雜合子GC型發(fā)病危險(xiǎn)度是對照組GG型的2．051倍，而突變純合子型與RA的發(fā)病無關(guān)，PTPN22 G-1123C SNP存在雜種優(yōu)勢現(xiàn)

12、象。 2、PTPN22 G-1123C SNP與RA患者RF因子的產(chǎn)生有關(guān)，與RA患者的發(fā)病起始年齡、X線檢查是否存在骨關(guān)節(jié)損傷無關(guān)；三組不同基因型RA患者的臨床特征，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與本次研究中收集的樣本量較少有關(guān)。 3、突變病人組PTPN22mRNA表達(dá)量高于野生型健康對照組，可能是由于啟動(dòng)子區(qū)域G-1123C位點(diǎn)基因突變后影響了LYP蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，機(jī)體為代償這一功能缺陷而作出的保護(hù)性反應(yīng)。PTPN22 G-11

13、23C SNP致病機(jī)制可能是通過-1123C影響與轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白4（AP-4）的中心基序區(qū)域（-1130gcaaGCTGaa-1121）的結(jié)合，使得PTPN22基因mRNA的轉(zhuǎn)錄激活受阻，LYP蛋白合成減少，最終影響T細(xì)胞信號中已磷酸化的重要酪氨酸激酶Src家族脫磷酸化，破壞了Lyp協(xié)同Csk抑制T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，T細(xì)胞活性上調(diào)，免疫平衡遭到破壞，顯著增加RA患者的發(fā)病危險(xiǎn)性。 4、本次實(shí)驗(yàn)為研究RA患者的發(fā)病機(jī)制提供了新