早期斷奶仔豬腸細(xì)胞凋亡分子機(jī)理及營養(yǎng)調(diào)控研究.pdf

1、早期斷奶引起的仔豬早期斷奶應(yīng)激綜合癥是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的大事件，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。早期斷奶給仔豬造成的最明顯損傷就是導(dǎo)致仔豬腸道屏障功能損傷。有研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡紊亂會導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙和胃腸功能損傷，而自由基代謝異常與凋亡紊亂密切相關(guān)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，早期斷奶會導(dǎo)致仔豬血清中H2O2和NO含量增加、抗氧化能力降低。但是斷奶導(dǎo)致的仔豬自由基代謝異常與腸細(xì)胞凋亡及腸屏障功能之間的關(guān)系仍未可知。N-乙酰半胱氨酸(N-ace

2、tylcysteine，NAC)，作為一種強(qiáng)有效的抗氧化劑，已廣泛應(yīng)用于臨床疾病治療研究，但對于其能否調(diào)控斷奶應(yīng)激仔豬的自由基代謝和腸道細(xì)胞凋亡過程，減少腸道屏障損傷，緩解斷奶應(yīng)激綜合癥及其機(jī)理還未見報道，為此，本文開展以下四個研究
　　1早期斷奶過程中仔豬腸道細(xì)胞凋亡研究
　　以酶學(xué)ELISA法分析Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，利用原位缺口末端標(biāo)記、透射電鏡法觀察腸組織形態(tài)變化，并對凋亡相

3、關(guān)基因（Caspase-3、8、9、Bcl-2和Bax基因）進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析，研究21日齡斷奶仔豬腸道細(xì)胞的凋亡過程，探討斷奶仔豬腸細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理。結(jié)果顯示，早期斷奶會導(dǎo)致仔豬腸道組織DNA呈片段化，斷奶后仔豬血清凋亡酶Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的含量顯著高于(P＜0.05）對照哺乳組。形態(tài)學(xué)觀察顯示，斷奶后仔豬腸細(xì)胞凋亡顯著增加，腸細(xì)胞凋亡指數(shù)極顯著高于對照哺乳組(P＜0.01)，凋亡染色

4、主要著色于腸絨毛頂端舌尖位置，而對照組仔豬腸絨毛著色較少。斷奶后，仔豬某些腸細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的壞死特征:細(xì)胞膜破裂、相鄰細(xì)胞間的緊密連接喪失、線粒體破壞。另有一些腸細(xì)胞表現(xiàn)為明顯凋亡特性:微絨毛脫落、稀疏排列，線粒體邊緣化，細(xì)胞膜皺縮。而對照哺乳組仔豬小腸黏膜表面微絨毛排列較緊密，細(xì)胞連接較緊密。定量結(jié)果顯示，斷奶后仔豬腸道中促凋亡基因Bax和Caspase-9表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)，而抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)，死亡受體基因

5、Fas(P＜0.01)和促凋亡基因Caspase-3和Caspase-8基因(P＜0.05)表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)果表明，斷奶會導(dǎo)致仔豬腸組織DNA片段化，凋亡酶活性增加，促進(jìn)腸細(xì)胞凋亡，且凋亡與壞死同時存在，凋亡的內(nèi)源性和外源性途徑都被激活。
　　2早期斷奶仔豬自由基代謝與腸細(xì)胞凋亡及腸道屏障功能關(guān)系研究
　　分別測定21日齡斷奶仔豬血清和腸道中CAT、SOD、GSH-Px、MDA活性。利用ELISA檢測血清皮質(zhì)醇、HIF-1α

6、、TNF-α水平，通過研究斷奶過程中仔豬抗氧化能力、腸道的通透性和小腸粘膜中整合素αvβ6和跨膜蛋白Occludin蛋白和連接蛋白ZO-1的mRNA表達(dá)，探討斷奶仔豬的腸道屏障的功能。采用多元分析法建立自由基與斷奶仔豬腸細(xì)胞凋亡和腸道屏障功能的關(guān)聯(lián)分析，探討斷奶仔豬自由基代謝與細(xì)胞凋亡和腸道屏障功能的關(guān)系。
　　結(jié)果顯示:斷奶后仔豬血清中皮質(zhì)醇、HIF-1α和TNF-α含量顯著高于(P＜0.05）對照哺乳組，斷奶后仔豬血清SOD和

7、GSH-Px酶活力顯著降低（P＜0.05）。斷奶后，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著增加(P＜0.05)，而血清抑制羥自由基的能力顯著下降(P＜0.05)。斷奶后血清NO和H2O2的含量與對照哺乳組無顯著性差異(P＞0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示，斷奶后仔豬腸道中整合素avβ6(P＞0.01)表達(dá)顯著上調(diào)，而緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和Occludin-1表達(dá)極顯著下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)果表明，斷奶會導(dǎo)致仔豬血清抗氧化能力降低以及緊密連

8、接表達(dá)下降，導(dǎo)致腸屏障功能障礙。斷奶導(dǎo)致的仔豬腸細(xì)胞凋亡增加與整合素αvβ6的表達(dá)密切聯(lián)系，且凋亡的增加與抗氧化能力的降低和自由基代謝增加顯著相關(guān)。
　　3斷奶仔豬小腸基因表達(dá)譜及細(xì)胞凋亡代謝網(wǎng)絡(luò)分析
　　采用全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)分析早期斷奶仔豬腸道差異表達(dá)基因，探索早期斷奶仔豬腸道代謝途徑變化與斷奶應(yīng)激間的關(guān)系，重點(diǎn)分析腸細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的差異，獲取與仔豬斷奶應(yīng)激密切相關(guān)的目標(biāo)基因，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析差異表達(dá)基因

9、的功能及其與斷奶仔豬腸道細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并以qRT-PCR技術(shù)研究相關(guān)目標(biāo)基因的表達(dá)量，繪制腸道細(xì)胞凋亡信號通路圖，從基因水平上闡明斷奶應(yīng)激仔豬腸道細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　通過豬的全基因組芯片，篩選出了445個差異表達(dá)基因，其中159個表達(dá)下調(diào)，286個表達(dá)上調(diào)。與細(xì)胞活動過程相關(guān)的上調(diào)基因51個，下調(diào)基因25個，這些基因主要參與細(xì)胞分化、細(xì)胞移位、細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期等。KEGG分析顯示，下調(diào)基因主要富集于免疫應(yīng)答調(diào)控途徑，而上調(diào)基

10、因主要富集于細(xì)胞凋亡途徑、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及內(nèi)分泌調(diào)控途徑。定量結(jié)果顯示，與凋亡相關(guān)基因(CYCS、BAD和ATM)，促炎因子(IL-8和TNF)以及轉(zhuǎn)錄因子（NFATC2和NOS2）表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因E2F5和Smad4以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子C-JUN表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明，斷奶后，仔豬腸細(xì)胞調(diào)控過程最為活躍。斷奶會導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，加速細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，解析了斷奶應(yīng)激綜合癥的機(jī)制，為開發(fā)緩解斷奶應(yīng)激綜合癥的新方法提供理論依據(jù)。

11、
　　4 NAC對斷奶仔豬腸屏障功能的調(diào)控及作用機(jī)理
　　通過在21日齡斷奶仔豬日糧中添加NAC，初步研究NAC對早期斷奶仔豬抗氧化能力及腸道細(xì)胞凋亡的影響，選擇細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因進(jìn)行mRNA表達(dá)分析，探討NAC對斷奶仔豬腸道細(xì)胞凋亡和腸道屏障損傷修復(fù)作用的分子機(jī)理。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC可有效降低斷奶仔豬血清中皮質(zhì)醇含量(P＜0.05)，降低HIF-1α的水平(P＜0.05)，但對TNF-α的含量無顯著影

12、響(P＞0.05)。日糧中添加NAC可顯著提高血清SOD和GSH-Px以及肝臟中SOD活性（P＜0.05）。但是添加NAC對斷奶仔豬血清和肝臟MDA含量以及肝臟中GSH-Px的活性均無顯著影響（P＞0.05）。斷奶后仔豬腸道絨毛寬度和高度顯著降低(P＜0.05)，隱窩增生(P＜0.05)。NAC處理后，仔豬絨毛寬度和高度顯著增加(P＜0.05)，絨毛結(jié)構(gòu)相對完整。NAC日糧處理可有效降低細(xì)胞凋亡指數(shù)(P＜0.05)，減少腸細(xì)胞凋亡。透射

13、電鏡結(jié)果顯示，NAC處理后，腸細(xì)胞形態(tài)完整，小腸黏膜表面微絨毛排列緊密。相較于斷奶組，NAC處理后，凋亡相關(guān)基因死亡受體Fas表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)，抑制凋亡基因Bcl-2顯著上調(diào)(P＜0.05)，Caspase-8、9表達(dá)雖有下降但無顯著性差異(P=0.141，P=0.206)。仔豬腸細(xì)胞周期調(diào)控基因E2F5、Smad4表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，凋亡啟動子基因ATM表達(dá)呈上調(diào)趨勢，創(chuàng)傷愈合指示基因整合素αvβ6表達(dá)顯著下調(diào)(

14、P＜0.05)。表明NAC在一定程度上可以緩減仔豬斷奶應(yīng)激，提高仔豬抗氧化能力，抑制腸細(xì)胞死亡，保護(hù)腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。NAC對斷奶仔豬腸細(xì)胞的保護(hù)不僅僅是簡單的調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑，還涉及到細(xì)胞周期調(diào)控。
　　綜上所述，早期斷奶造成的氧化應(yīng)激會導(dǎo)致仔豬抗氧化能力降低、自由基代謝異常，進(jìn)而激活腸細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性和外源性途徑，加速腸細(xì)胞凋亡，引起腸屏障功能障礙。斷奶后腸細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象同時存在。斷奶仔豬腸細(xì)胞凋亡的增加與仔豬抗氧化能力