早期斷奶仔豬腸細胞凋亡分子機理及營養(yǎng)調控研究.pdf

1、早期斷奶引起的仔豬早期斷奶應激綜合癥是養(yǎng)豬生產中的大事件，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。早期斷奶給仔豬造成的最明顯損傷就是導致仔豬腸道屏障功能損傷。有研究證實，細胞凋亡紊亂會導致腸黏膜屏障功能障礙和胃腸功能損傷，而自由基代謝異常與凋亡紊亂密切相關。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，早期斷奶會導致仔豬血清中H2O2和NO含量增加、抗氧化能力降低。但是斷奶導致的仔豬自由基代謝異常與腸細胞凋亡及腸屏障功能之間的關系仍未可知。N-乙酰半胱氨酸(N-ace

2、tylcysteine，NAC)，作為一種強有效的抗氧化劑，已廣泛應用于臨床疾病治療研究，但對于其能否調控斷奶應激仔豬的自由基代謝和腸道細胞凋亡過程，減少腸道屏障損傷，緩解斷奶應激綜合癥及其機理還未見報道，為此，本文開展以下四個研究
　　1早期斷奶過程中仔豬腸道細胞凋亡研究
　　以酶學ELISA法分析Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，利用原位缺口末端標記、透射電鏡法觀察腸組織形態(tài)變化，并對凋亡相

3、關基因（Caspase-3、8、9、Bcl-2和Bax基因）進行qRT-PCR表達分析，研究21日齡斷奶仔豬腸道細胞的凋亡過程，探討斷奶仔豬腸細胞凋亡的分子機理。結果顯示，早期斷奶會導致仔豬腸道組織DNA呈片段化，斷奶后仔豬血清凋亡酶Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的含量顯著高于(P＜0.05）對照哺乳組。形態(tài)學觀察顯示，斷奶后仔豬腸細胞凋亡顯著增加，腸細胞凋亡指數(shù)極顯著高于對照哺乳組(P＜0.01)，凋亡染色

4、主要著色于腸絨毛頂端舌尖位置，而對照組仔豬腸絨毛著色較少。斷奶后，仔豬某些腸細胞表現(xiàn)為明顯的壞死特征:細胞膜破裂、相鄰細胞間的緊密連接喪失、線粒體破壞。另有一些腸細胞表現(xiàn)為明顯凋亡特性:微絨毛脫落、稀疏排列，線粒體邊緣化，細胞膜皺縮。而對照哺乳組仔豬小腸黏膜表面微絨毛排列較緊密，細胞連接較緊密。定量結果顯示，斷奶后仔豬腸道中促凋亡基因Bax和Caspase-9表達無顯著性差異(P＞0.05)，而抑凋亡基因Bcl-2表達下調，死亡受體基因

5、Fas(P＜0.01)和促凋亡基因Caspase-3和Caspase-8基因(P＜0.05)表達顯著上調。結果表明，斷奶會導致仔豬腸組織DNA片段化，凋亡酶活性增加，促進腸細胞凋亡，且凋亡與壞死同時存在，凋亡的內源性和外源性途徑都被激活。
　　2早期斷奶仔豬自由基代謝與腸細胞凋亡及腸道屏障功能關系研究
　　分別測定21日齡斷奶仔豬血清和腸道中CAT、SOD、GSH-Px、MDA活性。利用ELISA檢測血清皮質醇、HIF-1α

6、、TNF-α水平，通過研究斷奶過程中仔豬抗氧化能力、腸道的通透性和小腸粘膜中整合素αvβ6和跨膜蛋白Occludin蛋白和連接蛋白ZO-1的mRNA表達，探討斷奶仔豬的腸道屏障的功能。采用多元分析法建立自由基與斷奶仔豬腸細胞凋亡和腸道屏障功能的關聯(lián)分析，探討斷奶仔豬自由基代謝與細胞凋亡和腸道屏障功能的關系。
　　結果顯示:斷奶后仔豬血清中皮質醇、HIF-1α和TNF-α含量顯著高于(P＜0.05）對照哺乳組，斷奶后仔豬血清SOD和

7、GSH-Px酶活力顯著降低（P＜0.05）。斷奶后，脂質過氧化產物MDA含量顯著增加(P＜0.05)，而血清抑制羥自由基的能力顯著下降(P＜0.05)。斷奶后血清NO和H2O2的含量與對照哺乳組無顯著性差異(P＞0.05)。qRT-PCR結果顯示，斷奶后仔豬腸道中整合素avβ6(P＞0.01)表達顯著上調，而緊密連接相關蛋白ZO-1和Occludin-1表達極顯著下調(P＜0.05)。結果表明，斷奶會導致仔豬血清抗氧化能力降低以及緊密連

8、接表達下降，導致腸屏障功能障礙。斷奶導致的仔豬腸細胞凋亡增加與整合素αvβ6的表達密切聯(lián)系，且凋亡的增加與抗氧化能力的降低和自由基代謝增加顯著相關。
　　3斷奶仔豬小腸基因表達譜及細胞凋亡代謝網絡分析
　　采用全基因組表達譜芯片技術分析早期斷奶仔豬腸道差異表達基因，探索早期斷奶仔豬腸道代謝途徑變化與斷奶應激間的關系，重點分析腸細胞凋亡相關基因表達的差異，獲取與仔豬斷奶應激密切相關的目標基因，應用生物信息學技術分析差異表達基因

9、的功能及其與斷奶仔豬腸道細胞凋亡的關系，并以qRT-PCR技術研究相關目標基因的表達量，繪制腸道細胞凋亡信號通路圖，從基因水平上闡明斷奶應激仔豬腸道細胞凋亡的機制。
　　通過豬的全基因組芯片，篩選出了445個差異表達基因，其中159個表達下調，286個表達上調。與細胞活動過程相關的上調基因51個，下調基因25個，這些基因主要參與細胞分化、細胞移位、細胞死亡、細胞周期等。KEGG分析顯示，下調基因主要富集于免疫應答調控途徑，而上調基

10、因主要富集于細胞凋亡途徑、信號轉導途徑以及內分泌調控途徑。定量結果顯示，與凋亡相關基因(CYCS、BAD和ATM)，促炎因子(IL-8和TNF)以及轉錄因子（NFATC2和NOS2）表達上調，細胞周期調控相關基因E2F5和Smad4以及信號轉導因子C-JUN表達下調。結果表明，斷奶后，仔豬腸細胞調控過程最為活躍。斷奶會導致細胞周期停滯，加速細胞凋亡，抑制細胞增殖，解析了斷奶應激綜合癥的機制，為開發(fā)緩解斷奶應激綜合癥的新方法提供理論依據(jù)。

11、
　　4 NAC對斷奶仔豬腸屏障功能的調控及作用機理
　　通過在21日齡斷奶仔豬日糧中添加NAC，初步研究NAC對早期斷奶仔豬抗氧化能力及腸道細胞凋亡的影響，選擇細胞凋亡及細胞周期調控相關基因進行mRNA表達分析，探討NAC對斷奶仔豬腸道細胞凋亡和腸道屏障損傷修復作用的分子機理。
　　結果發(fā)現(xiàn)，NAC可有效降低斷奶仔豬血清中皮質醇含量(P＜0.05)，降低HIF-1α的水平(P＜0.05)，但對TNF-α的含量無顯著影

12、響(P＞0.05)。日糧中添加NAC可顯著提高血清SOD和GSH-Px以及肝臟中SOD活性（P＜0.05）。但是添加NAC對斷奶仔豬血清和肝臟MDA含量以及肝臟中GSH-Px的活性均無顯著影響（P＞0.05）。斷奶后仔豬腸道絨毛寬度和高度顯著降低(P＜0.05)，隱窩增生(P＜0.05)。NAC處理后，仔豬絨毛寬度和高度顯著增加(P＜0.05)，絨毛結構相對完整。NAC日糧處理可有效降低細胞凋亡指數(shù)(P＜0.05)，減少腸細胞凋亡。透射

13、電鏡結果顯示，NAC處理后，腸細胞形態(tài)完整，小腸黏膜表面微絨毛排列緊密。相較于斷奶組，NAC處理后，凋亡相關基因死亡受體Fas表達顯著下調(P＜0.05)，抑制凋亡基因Bcl-2顯著上調(P＜0.05)，Caspase-8、9表達雖有下降但無顯著性差異(P=0.141，P=0.206)。仔豬腸細胞周期調控基因E2F5、Smad4表達顯著上調(P＜0.05)，凋亡啟動子基因ATM表達呈上調趨勢，創(chuàng)傷愈合指示基因整合素αvβ6表達顯著下調(

14、P＜0.05)。表明NAC在一定程度上可以緩減仔豬斷奶應激，提高仔豬抗氧化能力，抑制腸細胞死亡，保護腸細胞結構的完整性。NAC對斷奶仔豬腸細胞的保護不僅僅是簡單的調控細胞凋亡途徑，還涉及到細胞周期調控。
　　綜上所述，早期斷奶造成的氧化應激會導致仔豬抗氧化能力降低、自由基代謝異常，進而激活腸細胞凋亡的內源性和外源性途徑，加速腸細胞凋亡，引起腸屏障功能障礙。斷奶后腸細胞凋亡和壞死現(xiàn)象同時存在。斷奶仔豬腸細胞凋亡的增加與仔豬抗氧化能力