氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腸上皮屏障的影響及其分子信號(hào)機(jī)理.pdf

1、本論文旨在研究氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腸上皮屏障的影響并探究其防治斷奶仔豬腹瀉的分子信號(hào)機(jī)理。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了氧化鋅對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)、腹瀉、應(yīng)激狀況、腸道菌群、腸道屏障和腸道炎癥的影響。在此基礎(chǔ)上通過體外試驗(yàn)進(jìn)一步探索氧化鋅保護(hù)腸道屏障的分子信號(hào)機(jī)制，解析其發(fā)揮作用的信號(hào)途徑以及關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，為氧化鋅替代產(chǎn)品的開發(fā)和有效解決斷奶仔豬腹瀉問題提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.氧化鋅對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)、腹瀉和腸道菌群的影響
　　試驗(yàn)

2、選取日齡（21±1d）和體重(6.1±0.4kg)相近“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬40頭，隨機(jī)分成2組，單欄飼養(yǎng)，分別飼喂基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組）、基礎(chǔ)日糧+2200mg/kg氧化鋅形式的鋅（氧化鋅組）。試驗(yàn)期14d，于斷奶后第7d和14d屠宰取樣待測(cè)。結(jié)果表明:1）氧化鋅顯著提高了仔豬斷奶后0-7d和7-14d平均日增重和日采食量(P＜0.05)，對(duì)料重比影響不顯著(P＞0.05)，降低了仔豬斷奶后4-14d腹瀉率和4-11d的糞便指數(shù)(

3、P＜0.05)。2)氧化鋅對(duì)斷奶后第1d、2d和7d仔豬血漿皮質(zhì)醇和促腎上腺激素釋放激素(CRH)含量影響不顯著(P＞0.05)，顯著降低了斷奶后第7天腸黏膜CRH表達(dá)和含量(P＜0.05)。3)腸道菌群16SrRNA熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化鋅對(duì)大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量影響不顯著(P＞0.05)，顯著提高了乳酸桿菌/大腸桿菌比例(P＜0.05);高通量測(cè)序結(jié)果表明，氧化鋅顯著提高了Weissella、Leuconostoc、Streptoc

4、occus相對(duì)豐度(P＜0.05)，降低了Sarcina相對(duì)豐度(P＜0.05)，對(duì)Clostridium、Enterococcus、nterobacter和Lactobacillus相對(duì)豐度影響不顯著（P＞0.05），顯著提高了腸道菌群的OTU數(shù)和Shannon指數(shù)(P＜0.05)。4)氧化鋅顯著降低了仔豬斷奶后第7d仔豬血漿內(nèi)毒素濃度和第7d和14d腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌移位率(P＜0.05)。結(jié)果表明，氧化鋅對(duì)大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量影響

5、不顯著，降低了血漿內(nèi)毒素含量和細(xì)菌移位;提示氧化鋅可能不通過直接殺滅腸道細(xì)菌，而通過影響腸道屏障功能，緩解斷奶仔豬腹瀉。
　　2.氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腸道屏障和MAPKs通路的影響
　　本試驗(yàn)研究了氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腸黏膜屏障功能的影響。測(cè)定了氧化鋅對(duì)仔豬斷奶后7d和14d仔豬空腸絨毛形態(tài)、屏障功能、緊密連接蛋白表達(dá)以及MAPKs信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明:1）氧化鋅顯著提高了斷奶后7d空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度(V/C)(P

6、＜0.05)，而對(duì)隱窩深度影響不顯著(P＞0.05)。2）氧化鋅顯著提高了斷奶后7d和14d仔豬空腸跨上皮電阻(TER)值(P＜0.05)，降低了斷奶后第7d FD4通透性和血漿DAO活性(P＜0.05)。3)氧化鋅顯著提高了斷奶后第7d空腸黏膜Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)(P＜0.05)。4)氧化鋅顯著提高了斷奶后7d仔豬空腸黏膜ERK1/2激活(P＜0.05)，降低了p38和JNK激活(P＜0.05)。結(jié)果提

7、示，氧化鋅保護(hù)了斷奶仔豬腸道屏障，激活了ERK1/2通路，抑制了p38和JNK通路。
　　3.氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腸道炎癥的影響
　　腸道炎癥是斷奶引起的腸道屏障損傷的重要因素。本試驗(yàn)研究了氧化鋅對(duì)斷奶后仔豬空腸黏膜炎癥因子表達(dá)和含量、TLR和NOD受體信號(hào)通路和肥大細(xì)胞的影響，旨在探究氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腸道炎癥的影響及可能機(jī)制。結(jié)果表明:1）氧化鋅顯著降低了斷奶后第7d仔豬空腸黏膜TNF-α、IFN-γ、CXCL2和IL-6的表

8、達(dá)和含量(P＜0.05)，顯著提高了斷奶后第7d和14d TGF-β1的表達(dá)和含量(P＜0.05)。2)氧化鋅顯著降低了斷奶后7d仔豬空腸TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6表達(dá)(P＜0.05)，對(duì)NOD1、NOD2、RIPK2、NF-κB p65表達(dá)影響不顯著(P＞0.05)，降低了仔豬空腸NF-κB p65蛋白表達(dá)(P＜0.05)，對(duì)caspase-3、HSP70表達(dá)影響不顯著（P＞0.05）。3）氧化鋅顯著降低了仔豬空腸肥

9、大細(xì)胞數(shù)量、組胺和tryptase的含量(P＜0.05)，提高了chymase陽(yáng)性肥大細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)。4)離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化鋅組仔豬空腸對(duì)CRH引起的屏障功能損傷、肥大細(xì)胞脫顆粒等敏感性顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果提示，氧化鋅降低了TLR4通路信號(hào)分子和NF-κB表達(dá)，影響了肥大細(xì)胞數(shù)量、活性和類型，降低了腸道對(duì)CRH敏感性，緩解了腸道炎癥。
　　4.氧化鋅通過ERK1/2通路緩解了TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的腸上皮屏障

10、損傷
　　本論文試驗(yàn)2結(jié)果表明氧化鋅能夠保護(hù)仔豬腸道屏障并激活ERK1/2通路，但關(guān)于氧化鋅保護(hù)腸道屏障的分子信號(hào)機(jī)制還未有研究。本試驗(yàn)利用TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的體外豬腸上皮屏障損傷模型，研究了氧化鋅對(duì)TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的體外腸上皮屏障功能、緊密連接蛋白表達(dá)和分布及ERK1/2信號(hào)通路的影響，旨在解析氧化鋅保護(hù)腸上皮屏障的分子信號(hào)機(jī)制。結(jié)果表明:1）TNF-α/IFN-γ處理12h后導(dǎo)致腸上皮屏障TER顯著降低和FD

11、4通透性顯著升高(P＜0.05);氧化鋅預(yù)處理顯著緩解了TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的TER降低和FD4升高(P＜0.05)。2)TNF-α/IFN-γ處理顯著降低了腸上皮細(xì)胞Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)(P＜0.05)，導(dǎo)致Occludin分布紊亂;氧化鋅預(yù)處理顯著抑制了TNF-α/IFN-γ引起的緊密連接蛋白表達(dá)下降和Occludin分布紊亂(P＜0.05)。3）與TNF-α/IFN-γ處理組相比，氧化鋅預(yù)處理

12、顯著提高了ERK1/2通路的激活強(qiáng)度和時(shí)間(P＜0.05);阻斷ERK1/2通路顯著抑制了氧化鋅保護(hù)腸上皮屏障的作用及對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)和Occludin分布的調(diào)控(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，氧化鋅通過激活ERK1/2信號(hào)通路，調(diào)控緊密連接蛋白表達(dá)和分布，從而緩解了TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷。
　　本論文試驗(yàn)3結(jié)果表明氧化鋅降低了TLR4通路信號(hào)分子和NF-κB表達(dá)，緩解了腸道炎癥，但關(guān)于氧化鋅緩解腸道炎癥的分

13、子信號(hào)機(jī)制仍不完全清楚。本試驗(yàn)構(gòu)建了LPS(1μg/ml)誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞炎癥模型，旨在研究氧化鋅緩解腸道炎癥的分子信號(hào)機(jī)制。結(jié)果表明:1）LPS顯著提高了腸上皮細(xì)胞TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-8的表達(dá)(P＜0.05);而50μM和100μM ZnO預(yù)處理顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的TLR4和炎癥因子的表達(dá)(P＜0.05)。2）LPS顯著降低了IκBα含量(P＜0.05)，提高了p-IκBα含量（P＜0.05）;而ZnO(100

14、μM)預(yù)處理顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的IκBα升高（P＜0.05）和p-IκBα降低（P＜0.05）。3）LPS顯著降低了胞質(zhì)中NF-κB的含量(P＜0.05)，提高了胞核中NF-κB的含量(P＜0.05);而ZnO（100μM）預(yù)處理顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的胞質(zhì)NF-κB的降低和胞核NF-κB的升高(P＜0.05)。4)LPS提高了NF-κB(p65)入核;而氧化鋅預(yù)處理顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的NF-κB(p65)的入核。結(jié)果提示，氧化鋅通過

15、抑制LPS誘導(dǎo)的IκB磷酸化和NF-κB入核，降低了LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞TLR4受體及炎癥因子的表達(dá)，緩解了腸道炎癥。
　　7.氧化鋅對(duì)肥大細(xì)胞和上皮細(xì)胞的互作的影響
　　試驗(yàn)3結(jié)果表明氧化鋅顯著影響了斷奶仔豬空腸肥大細(xì)胞的數(shù)量、活性和類型，但關(guān)于肥大細(xì)胞在氧化鋅保護(hù)腸道屏障中的作用仍未見研究報(bào)道。本試驗(yàn)通過構(gòu)建肥大細(xì)胞（LAD2細(xì)胞）和上皮細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞）共培養(yǎng)模型，旨在研究氧化鋅對(duì)肥大細(xì)胞和上皮細(xì)胞互作的影響，

16、解析氧化鋅緩解腸上皮炎癥反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果表明:1）Caco-2與LAD2細(xì)胞共培養(yǎng)顯著提高了IL-2、IL-6和IL-8表達(dá)和含量(P＜0.05)。2）Caco-2與LAD2細(xì)胞共培養(yǎng)，LAD2細(xì)胞通過直接接觸和間接作用促進(jìn)了Caco2細(xì)胞IL-2、IL-6和IL-8的分泌(P＜0.05)。3)Caco-2與LAD2細(xì)胞共培養(yǎng)激活了MAPKs(ERK、p38MAPK和JNK)和NF-κB通路，阻斷MAPKs和NF-κB通路顯著降低了

17、IL-2、IL-6和IL-8的分泌(P＜0.05)。4）氧化鋅預(yù)處理Caco-2細(xì)胞顯著降低了共培養(yǎng)誘導(dǎo)的IL-2、IL-6和IL-8的分泌(P＜0.05)。結(jié)果提示，氧化鋅通過影響肥大細(xì)胞和上皮細(xì)胞互作，降低炎癥因子分泌，緩解了腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　綜上所述，日糧添加高劑量氧化鋅改善了斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，降低了仔豬腹瀉，緩解了斷奶應(yīng)激。其緩解斷奶應(yīng)激的作用與其保護(hù)腸道屏障密切有關(guān)。氧化鋅主要通過激活ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)TG