絹絲昆蟲線粒體DNA A+T豐富區(qū)序列的克隆與分子進化分析.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是鱗翅目的一種重要模式昆蟲，對其起源和分化的研究一直受到蠶業(yè)科學界的高度重視，并隨著科學技術(shù)的進步和考古發(fā)現(xiàn)而不斷推向深入，取得了很大的進展。家蠶的中國起源學說已經(jīng)成為學界的共識，然而對于家蠶起源的地域性和化性分化卻一直存在著爭論，形成了兩種不同的學說：家蠶起源黃河流域的“一中心”學說和多地域起源的“多中心”學說。 動物線粒體DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）具有分子量小、便于

2、實驗操作、變異速度快和母性遺傳等特點，被廣泛用于種群遺傳和物種分子進化分析。mtDNA控制區(qū)（D-環(huán)）因富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T），被稱為A+T豐富區(qū)，是動物線粒體基因組序列和長度變異最大的區(qū)域。利用線粒體DNA基因組中保守性的蛋白質(zhì)編碼基因或rRNA基因等序列分析家蠶和蓖麻蠶（Philosamia cynthia ricini）等絹絲昆蟲系統(tǒng)發(fā)育和分子進化已有較多報道，但是鮮見用線粒體基因組A+T豐富區(qū)分析家蠶等絹絲昆蟲的進化。

3、 本研究選擇12個家蠶品種以及鎮(zhèn)江野桑蠶（Bombyx mandarina Zhenjiang strain）、蓖麻蠶、樗蠶（Philosamia cynthia cynthia）和柳蠶（Actias selene ningdoana）為材料，分別從蛹體中提取線粒體DNA。家蠶品種分別為：三四、大草、邯鄲種、邁索爾、大造、薩尼斯、余杭二化、沿河1號、新昌12號、安康4號、甘肅種、蘭5，從化性上分包括一化性、二化性和多化性品種，從

4、地理系統(tǒng)上劃分包括中國系統(tǒng)、日本系統(tǒng)、歐洲系統(tǒng)和熱帶系統(tǒng)，從繭色上劃分包括白色、橘紅色、淡橘紅色、金黃色、淡黃綠色。根據(jù)已發(fā)表的家蠶和野桑蠶mtDNA控制區(qū)及其側(cè)翼序列，設計1對PCR引物，用PCR方法克隆線粒體A+T豐富區(qū)及其側(cè)翼序列，并進行序列測定。 序列分析表明，家蠶品種克隆片段平均長度約1.1 kb，鎮(zhèn)江野桑蠶的克隆片段為1085 bp，蓖麻蠶、樗蠶和柳蠶該區(qū)段長度分別為951 bp、952 bp和930 bp，它們的基

5、因排列順序均與家蠶品種C108相同，依次為12S rRNA基因3′ 端、A+T豐富區(qū)、tRNA-Met、tRNA-Ile、tRNA-Gln和ND2基因5′ 端，在tRNA-Gln和ND2基因之間有一段非編碼區(qū)。家蠶品種的克隆片段及C108和青熟（Aojuku）間核苷酸序列的同源性均在99％以上，其中C108、蘭5和青熟三者完全一致；沿河1號和大造與C108相比，只在控制區(qū)的T-串（Thymine-stretch）和A-串（Adenine

6、-stretch）長度上有1-2個堿基的差異；在14個品種中，共檢測到19個堿基替換（15個轉(zhuǎn)換，4個顛換）和6個堿基缺失，主要分布在A+T豐富區(qū)。 為了研究家蠶品種的起源以及家蠶和大蠶蛾科絹絲昆蟲的親緣關系，我們以黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）線粒體DNA為外群，分別采用Phylip3.66軟件包的鄰位相連法（DNA NJ）和最大可能性法（DNA ML），構(gòu)建了基于14個家蠶品種和4個野桑蠶品系mtD

7、NA A+T豐富區(qū)及其側(cè)翼序列的進化樹和基于2個家蠶品種和柞蠶（Antheraea pernyi）、蓖麻蠶、樗蠶、柳蠶4種5個品系的大蠶蛾科絹絲昆蟲mtDNA A+T豐富區(qū)序列的進化樹。在前一進化樹中，14個家蠶品種與2個中國野桑蠶聚為一亞群，而2個日本野桑蠶單獨聚為另一亞群，說明家蠶品種與中國野桑蠶的親緣關系更近、與日本野桑蠶（Japanese Bombyx mandarina）較遠；在14個家蠶品種中，甘肅種的進化早于其它品種，說明