菊花腦低氮脅迫表達譜分析及microRNA挖掘.pdf

1、菊花腦（Chrysanthemum nankingense）是原產(chǎn)中國的菊屬二倍體物種，參與多倍體菊花（C.morifolium）的起源。氮素是植物生長所必須礦質(zhì)元素之一。所以挖掘與低氮脅迫相關(guān)的基因或miRNA，對提高菊屬植物氮素利用率，減少氮素流失有重要的意義。
　　本研究以菊花腦為實驗材料，采用Illumina高通量測序技術(shù)，分另構(gòu)建了四個小分子文庫和四個cDNA文庫，處理材料如下:最適生長的氮素濃度4 mmol L-1 N

2、O3-處理的根;低氮濃度0.04 mmol L-1 NO3-處理的根;最適生長的氮素濃度4mmol L-1NO3-處理的葉片;低氮濃度0.04 mmol L-1 NO3-處理的葉片。對表達譜和miRNA數(shù)據(jù)分別進行分析，主要結(jié)果如下:
　　(1)四個cDNA文庫都獲得的大約7，000，000的clean reads。根非脅迫對照與根低氮脅迫組（R-sample）所得數(shù)據(jù)進行分析，差異表達基因有1，510個，其中上調(diào)基因458個，下

3、調(diào)基因1052個;葉非脅迫對照與葉低氮脅迫組（L-sample）所得數(shù)據(jù)進行分析，差異表達基因有686個，其中上調(diào)基因419個，下調(diào)基因267個。根中與葉中差異表達基因相同的上調(diào)基因109個，下調(diào)基因67個。分別對根、葉的差異表達基因進行Gene Ontology功能分類和KEGG pathway顯著性富集分析，以序列同源性為基礎(chǔ)，分別把2，855和691條序列分成42和34個功能組。通過KEGG分析，在R-sample中，423個序列

4、被富集為94個pathway;在L-sample中，138個序列被富集為94個pathway。
　　(2)對差異表達基因進行歸類分析，涉及光合作用、轉(zhuǎn)錄因子、氮素代謝和激酶。其中有2個與氮轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因(Unigene36710_S2_1，Unigene82641_S2_1)。為了檢測數(shù)據(jù)的可靠性，隨機抽選了15個基因進行qRT-PCR驗證。qRT-PCR驗證結(jié)果與高通量測序所測得結(jié)果的上調(diào)或下調(diào)趨勢保持一致，說明測序結(jié)果可靠。<

5、br>　　(3)通過HiSeq深度測序檢測菊花腦根部和葉片低硝酸鹽響應(yīng)的miRNA，并對其進行生物信息學分析。在根部檢測到的差異表達2倍及以上的miRNA共82個，其中上調(diào)表達29個，下調(diào)表達53個;在葉片檢測到的差異表達2倍以上的miRNA共102個，其中上調(diào)表達40個，下調(diào)表達62個。其中發(fā)現(xiàn)與已報道的響應(yīng)低氮脅迫的同家族的miRNA，根部有miR169i-3p，miR398a-5p，葉片中有miR169r-3p和miR393a-3

6、p等。
　　(4)通過軟件預(yù)測了差異表達的已知miRNA的靶基因。根部可預(yù)測到靶基因的miRNA數(shù)量為37，預(yù)測到的靶基因數(shù)量是219個，靶基因miRNA結(jié)合位點數(shù)量是235;葉片可預(yù)測到靶基因的miRNA的數(shù)量是44，預(yù)測到的靶基因個數(shù)是219，靶基因miRNA結(jié)合位點數(shù)量是204。根據(jù)預(yù)測靶基因的功能特性分為三類:靶基因與代謝相關(guān)，靶基因編碼轉(zhuǎn)錄因子和靶基因編碼激酶。我們隨機抽取miRNA及預(yù)測的靶基因進行qRT-PCR驗證，