鼻咽癌染色體12p12-11區(qū)段擴(kuò)增基因的篩選及其功能研究.pdf

1、12p12-11擴(kuò)增基因的篩選
　　 染色體擴(kuò)增常導(dǎo)致瘤基因拷貝數(shù)增加和過表達(dá),通過檢測腫瘤組織中染色體擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)候選瘤基因的過表達(dá)已經(jīng)成為尋找特定腫瘤相關(guān)瘤基因的重要途徑。染色體12p12-11長度為19Mb,包含123個(gè)已知基因和表達(dá)序列標(biāo)簽。已有研究表明,+12p是大腸癌的早期事件,可能是生殖細(xì)胞腫瘤的晚期事件以及卵巢癌的中晚期事件。利用MEDLINE文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫及本實(shí)驗(yàn)室已完成的鼻咽癌cDNA微陣列數(shù)據(jù)資料,我們從12p1

2、2-11區(qū)初步確定了18個(gè)鼻咽癌相關(guān)候選瘤基因,其中已明確的瘤基因及候選瘤基因有6個(gè),另外12個(gè)基因與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖相關(guān)。采用RT-PCR和定量RT-PCR方法檢測鼻咽癌和慢性鼻咽炎組織中這18個(gè)基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:其中9個(gè)基因在慢性鼻咽炎與鼻咽癌組織中均無表達(dá);5個(gè)基因表達(dá)水平在36例鼻咽癌及8例慢性鼻咽炎組織之間無顯著差異;而有4個(gè)基因,提示其可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。其中KCNJ8為ATP-敏感鉀離子通道基因的一個(gè)亞類,與

3、細(xì)胞的分泌和肌肉收縮有關(guān),而與腫瘤發(fā)生及細(xì)胞的生長、增殖相關(guān)報(bào)道較少;PTX1主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間物質(zhì)的膜運(yùn)輸,僅發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌中表達(dá)下調(diào);KRAS2在鼻咽癌中的研究頗多,其表達(dá)明顯高于慢性鼻咽炎;而BCAT1基因編碼支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶,在Burkitt's淋巴瘤、乳腺癌組織中明顯上調(diào),與細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān),在鼻咽癌中尚未有相關(guān)報(bào)道。
　　 BCAT1基因在鼻咽癌不同病理階段中的表達(dá)
　　 從12p12-11篩選

4、出的相關(guān)瘤基因回到癌前病變各階段去考察能認(rèn)識這些基因在鼻咽癌發(fā)病過程中的真正地位和意義,因此我們采用了免疫組化分析BCAT1蛋白在鼻咽正常上皮、增生活躍、輕中度、重度增生和鼻咽癌組織中的表達(dá)。結(jié)果表明,在正常假復(fù)層纖毛柱狀上皮、復(fù)層鱗狀上皮、輕中度增生、重度增生和鼻咽癌組織中均能檢測到BCAT1蛋白不同程度的陽性表達(dá),陽性信號定位于細(xì)胞胞漿中;BCAT1蛋白在正常上皮、輕中度增生、重度增生和鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率分別為23.6％、75％

5、、88.9％和88.75;結(jié)果提示在鼻咽部出現(xiàn)輕度增生早期病理改變時(shí),BCAT1的表達(dá)就明顯增高,這說明BCAT1基因?qū)τ诒茄拾┑陌l(fā)生可能起重要作用,這也為進(jìn)一步分析該基因表達(dá)異常的分子機(jī)制提供了依據(jù)。
　　 探討B(tài)CAT1基因在鼻咽癌中異常表達(dá)的可能機(jī)制
　　 探討瘤基因表達(dá)上調(diào)的機(jī)制主要從遺傳學(xué)改變和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩方面進(jìn)行。首先,通過PCR結(jié)合測序的方法分析20例鼻咽癌中BCAT1的11個(gè)外顯子突變情況,共檢測出1個(gè)

6、外顯子區(qū)SNP位點(diǎn),提示基因突變對BCAT的表達(dá)無明顯影響。其次,拷貝數(shù)增加被認(rèn)為是瘤基因異常激活的一個(gè)重要機(jī)制,分析基因內(nèi)部及其附近微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增可以間接反映基因組中基因的擴(kuò)增情況。采用Real-timePCR分析了BCAT1基因內(nèi)部D12S1435、D12S1617和RH44650三個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在鼻咽癌組織中擴(kuò)增情況。
　　 真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,而轉(zhuǎn)錄因子參與的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用。生物信息學(xué)分析顯示

7、在BCAT15'端非翻譯區(qū)-155/-200bp區(qū)域包含有c-Myc結(jié)合位點(diǎn)。為了揭示c-Myc是否對BCAT1的表達(dá)具有直接調(diào)控作用,我們進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí),c-Myc轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合于BCAT1基因啟動子區(qū)的c-Myc結(jié)合位點(diǎn)。RT-PCR與免疫組化表明鼻咽癌中BCAT1和c-Myc的mRNA和蛋白的表達(dá)均上調(diào),進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)建立了穩(wěn)定干擾c-Myc表達(dá)的5-8F鼻咽癌細(xì)胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),封閉內(nèi)源性c-M

8、yc的表達(dá)可以下調(diào)BCAT1基因mRNA的表達(dá)水平。另外,我們將帶有包含c-Myc結(jié)合位點(diǎn)的BCAT1調(diào)控序列與熒光素酶報(bào)告基因連接構(gòu)建重組報(bào)告基因載體,分別轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空白載體的5-8F細(xì)胞以及5-8F/si-c-myc細(xì)胞中,經(jīng)報(bào)告基因活性分析發(fā)現(xiàn),封閉內(nèi)源性c-Myc表達(dá)后,與對照組相比,重組報(bào)告基因的熒光素酶活性降低。而在轉(zhuǎn)染c-Myc基因的COS7細(xì)胞系中具有較強(qiáng)的熒光素酶活性。
　　 利用RNA干擾技術(shù)研究

9、BCAT1基因在5-8F細(xì)胞的作用
　　 采用pSUPER.retro逆病毒載體系統(tǒng),構(gòu)建了針對BCAT1的RNAi載體。經(jīng)測序結(jié)果證實(shí)后,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將shBCAT1導(dǎo)入5-8F細(xì)胞,嘌呤霉素篩選獲得抗性克隆,PCR證實(shí)抗性克隆中含有shBCAT1;RT-PCR結(jié)果表明,shBCAT1表達(dá)載體能特異性導(dǎo)致BCAT1mRNA的表達(dá)下調(diào)了90％;Western:Blotting分析表明細(xì)胞中的BCAT1蛋白表達(dá)下調(diào)了55％左

10、右,這些說明我們已成功地建立了穩(wěn)定干擾BCAT1基因的5-8F細(xì)胞系。
　　 隨后,我們進(jìn)一步考察了BCAT1被干擾后對5-8F細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染了shBCAT1的5-8F細(xì)胞阻滯于G1期,G1期細(xì)胞比例增加～16.66％,G2期細(xì)胞則減少了～6.91％,而對照組5-8F細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的5-8F細(xì)胞之間的細(xì)胞周期分布沒有明顯差異。MTT法檢測發(fā)現(xiàn),5-8F-shBCAT1細(xì)胞增殖速度明顯低于對

11、照組5-8F細(xì)胞與5-8F-blankvector細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-8F-shBCAT1細(xì)胞的克隆形成率明顯低于轉(zhuǎn)染載體組。另外,遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí),5-8F-shBCAT1細(xì)胞運(yùn)動能力和侵襲能力明顯降低。
　　 BCAT1與LARS2在鼻咽癌中的相互作用及LARS2在鼻咽癌中下調(diào)機(jī)制的研究
　　 生物信息學(xué)是后基因組時(shí)代的利器。STRING是目前已知的、揭示已知和預(yù)測蛋白-蛋

12、白之間相互作用的、較廣泛使用的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫揭示的蛋白-蛋白相互作用既包括直接相互作用也包括間接關(guān)聯(lián)作用,其中數(shù)據(jù)來源于基因組背景分析、高通量實(shí)驗(yàn)、共表達(dá)實(shí)驗(yàn)和已公布的數(shù)據(jù)庫。同時(shí),利用STRING還可以比較不同物種間的數(shù)據(jù)。最新版STRING8.1收錄了630個(gè)物種、超過2,590,259種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。
　　 在STRING的界面,輸入BCAT1,可以找到直接和間接相關(guān)蛋白分子10個(gè),它們分別是LRMP、hCG26005、E

13、NSP00000372、BCKDHA、BCKDHB、IARS2、IARS、LARS2、LARS和BCAT1。從這些基因的染色體定位數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)LARS2基因位于鼻咽癌患者高頻丟失區(qū)3p21。
　　 LARS2基因編碼亮氨酰-tRNA合成酶。為了探討LARS2基因在鼻咽癌中的可能作用,我們首先采用了RT-PCR、Real-time PCR方法檢測LARS2在8例慢性鼻咽炎組織、36例鼻咽癌組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LARS2在7

14、8％鼻咽癌組織中存在表達(dá)下調(diào)或缺失,提示LARS2可能是鼻咽癌相關(guān)候選抑瘤基因。接著,我們從遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變兩方面探討了LARS2基因失活的主要機(jī)制。1.通過PCR-SSCP并結(jié)合測序方法分析了25例鼻咽癌中啟動子區(qū)和外顯子1突變情況,結(jié)果未檢測出突變和SNP,提示基因突變對于LARS2表達(dá)失活無明顯影響。2.由于基因內(nèi)部及其附近微衛(wèi)星位點(diǎn)的丟失可以間接反映基因組中基因的缺失情況,我們采用了PCR-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染方法

15、分析LARS2基因內(nèi)部的RH25266和SHGC-12886二個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在鼻咽癌組織中的丟失情況。結(jié)果表明,至少有28％的鼻咽癌組織中存在LARS2基因微衛(wèi)星位點(diǎn)的丟失,提示微衛(wèi)星位點(diǎn)的LOH可能對LARS2在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)起一定的作用。3.鑒于啟動子區(qū)DNA異常甲基化是抑瘤基因在表觀遺傳學(xué)改變最為常見的方式,我們首先通過生物信息學(xué)軟件對LARS2啟動子區(qū)CpG島分布情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)LARS2啟動子區(qū)存在一個(gè)227bp長的C

16、pG島。以此區(qū)域?yàn)槟０?選擇針對該區(qū)段的甲基化和非甲基化特異性引物,利用甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR,MSPCR)技術(shù),我們分析了慢性鼻咽炎和鼻咽癌組織中LARS2啟動子甲基化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),64％鼻咽癌組織和12.5％慢性鼻咽炎組織存在LARS2基因啟動子甲基化情況,但鼻咽癌組織中LARS2基因甲基化比率明顯高于慢性鼻咽炎組織,兩者存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這提示啟動子甲基化是導(dǎo)致LARS2基因表達(dá)下

17、調(diào)的主要因素。
　　 綜上所述,通過本研究,我們首次從鼻咽癌發(fā)生早期事件+12p12-11區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌相關(guān)瘤基因BCAT1,并系統(tǒng)、全面地考察了BCAT1蛋白在慢性鼻咽炎、鼻咽癌及鼻咽癌變不同階段組織中的表達(dá)情況,探討了導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)的可能機(jī)制,并進(jìn)一步研究了BCAT1基因在鼻咽癌細(xì)胞中的功能。結(jié)果提示,BCAT1在慢性鼻咽上皮組織和正常鼻咽上皮中正常表達(dá),而在鼻咽癌組織和鼻咽癌變不同階段明顯表達(dá)上調(diào),而這種表達(dá)上調(diào)主要是由

18、于基因擴(kuò)增所致,而瘤基因c-Myc對其直接調(diào)控也發(fā)揮了一定作用。RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明,干擾BCAT1的表達(dá)能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯。此外,我們通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)了與BCAT1蛋白有間接相互作用的LARS2蛋白。LARS2基因在鼻咽癌組織中表達(dá)明顯下調(diào),其失活機(jī)制主要是基因啟動子區(qū)甲基化。鼻咽癌中BCAT1顯著上調(diào)和LARS2表達(dá)下調(diào),共同導(dǎo)致了中間產(chǎn)物L(fēng)-亮氨酸的累積,而L-亮氨酸則可以通過激活mTOR的信號傳導(dǎo)通路最