蝙蝠病毒組學(xué)及其新病毒的發(fā)現(xiàn)與鑒定.pdf

1、蝙蝠是世界上僅次于嚙齒類的第二大類哺乳動(dòng)物，其分布于除兩極以外的地方，同時(shí)也是許多病毒的自然宿主。我國(guó)云南省地處西南邊陲，與緬甸、老撾、越南等東南亞國(guó)家接壤，戰(zhàn)略意義突出。該地區(qū)是多種疾病的疫源地，研究發(fā)現(xiàn)該地區(qū)蝙蝠攜帶有多種人獸共患病毒，如尼帕病毒(Nipah virus)、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、狂犬病毒(Rabiesvirus)、圓

2、環(huán)病毒(Circovirus)等。為了有效地監(jiān)控云南省及周邊地區(qū)新發(fā)傳染病(emerging infectious diseases，EID)，防止野生動(dòng)物（特別是蝙蝠）疫病，跨種和跨境傳播給其它動(dòng)物甚至是人類，保障邊境地區(qū)人民生命安全，徹底調(diào)查該地區(qū)蝙蝠病毒生態(tài)學(xué)具有重要的意義。而基于第二代高通量測(cè)序(High-throughputsequencing)的病毒宏基因組學(xué)(Viral metagenomics，ViralMeta)則為調(diào)

3、查已知和未知病毒提供了高效的工具。
　　本研究于2008年到2011年間，共收集到1，219份外表健康蝙蝠樣品，收集地點(diǎn)涵蓋鄰近云南省的緬甸的昔懂壩縣和吳濤縣以及我國(guó)云南省的6個(gè)市縣。蝙蝠涉及3個(gè)科:蝙蝠科（Vespertilionidae）、菊頭蝠科（Rhinolophidae）和假吸血蝠科(Megadermatidae)共5個(gè)屬11種。經(jīng)過ViralMeta處理一共得到326，318，951個(gè)堿基(nt)，總共5，864，63

4、6個(gè)讀長(zhǎng)(reads)，經(jīng)過拼接得到3，605，620個(gè)重疊序列(contigs)，其中2％的序列注釋到了病毒（Virus-like contigs，59，661/3，605，620）。這些病毒中可以進(jìn)一步分為27個(gè)科（包含細(xì)小病毒科中的細(xì)小病毒亞科和濃核病毒亞科），49個(gè)病毒屬，包含16個(gè)哺乳動(dòng)物病毒科22個(gè)屬、5個(gè)昆蟲病毒科8個(gè)屬、3個(gè)植物病毒科4個(gè)屬、3個(gè)噬菌體科15個(gè)屬。在哺乳動(dòng)物病毒中，有腺病毒科中的哺乳動(dòng)物腺病毒屬，皰疹病毒

5、科中的細(xì)胞巨化病毒屬、馬立克病病毒屬、玫瑰疹病毒屬，異樣皰疹病毒科中的魚皰疹病毒屬，乳頭瘤病毒科中的甲型乳頭瘤病毒屬，多頭瘤病毒科中的多頭瘤病毒屬，小雙節(jié)RNA病毒科中的小雙節(jié)RNA病毒屬，嗜肝病毒科中的正嗜肝病毒屬，圓環(huán)病毒科中的圓環(huán)病毒屬，痘病毒科中的正痘病毒屬，逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的γ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬、△逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，細(xì)小病毒亞科中的依賴病毒屬、博卡病毒屬，星狀病毒科中的哺乳動(dòng)物星狀病毒屬，呼腸孤病毒科中的A型輪狀病毒，冠狀病毒科中的僅冠狀

6、病毒屬、β冠狀病毒屬，小RNA病毒科中的嵴病毒屬、腸道病毒屬，黃病毒科中的丙肝病毒屬。通過比較發(fā)現(xiàn)，蝙蝠種群和地域之間病毒組具有顯著的差異，主要體現(xiàn)在病毒的種類、病毒序列與已知序列的同源性差異、病毒序列的豐度等方面。通過該方法充分反應(yīng)了該地區(qū)蝙蝠攜帶病毒組的情況。
　　根據(jù)病毒宏基因組學(xué)結(jié)果，針對(duì)有意義的新發(fā)現(xiàn)的腺病毒、正嗜肝病毒、星狀病毒、冠狀病毒、輪狀病毒、軟腐病毒等，建立了特異性PCR/RT-PCR檢測(cè)方法，獲得了這些病毒在

7、蝙蝠體內(nèi)的帶毒率情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)緬甸吳濤縣1％(1/84)的大蹄蝠（Hipposideros armiger）攜帶腺病毒，緬甸昔懂壩縣2％(7/320)和吳濤縣5％(15/320)的亞洲長(zhǎng)翼蝠(Miniopterus fuliginosus)以及我國(guó)云南省普洱市20％(4/20)果樹蹄蝠(Hipposideros pomona)攜帶正嗜肝病毒，緬甸吳濤縣2％(2/84)的馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferrumequinum)攜帶

8、星狀病毒，祥云11％(13/120)、賓川7％(7/100)、景洪的6％(2/34)的鼠耳蝠為α冠狀病毒(Coronavirus，CoV)陽(yáng)性，而來自保山的14％(2/14)的中菊頭蝠(Rhinolophus affinis為β冠狀病毒陽(yáng)性，德宏6％(1/16)的小菊頭蝠(Rhinolophus hipposideros)攜帶輪狀病毒，而軟腐病毒則廣泛分布在蝙蝠體內(nèi)。對(duì)擴(kuò)增的部分片段進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)這些病毒同已知病毒的核苷酸同源性不足

9、85％，提示這些病毒為新型的蝙蝠病毒。
　　針對(duì)以上檢測(cè)結(jié)果，挑選了肝炎病毒、冠狀病毒和輪狀病毒進(jìn)行深入的分析。獲得了3株緬甸和3株云南蝙蝠肝炎病毒的全基因組序列，分析發(fā)現(xiàn)緬甸和云南省的蝙蝠肝炎病毒基因組呈現(xiàn)典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且具有明確的進(jìn)化差異，兩者間核苷酸同源性僅為70％，同已知的正嗜肝病毒均具有顯著的差異性，核苷酸同源性不足60％，說明發(fā)現(xiàn)了兩株新型的肝炎病毒;抗原性分析推測(cè)該病毒可能與人的乙肝病毒發(fā)生交叉反應(yīng);直接從樣品中電

10、鏡觀察到了大量的澳大利亞抗原，進(jìn)一步證實(shí)蝙蝠攜帶肝炎病毒;這是全球首次發(fā)現(xiàn)蝙蝠肝炎病毒，極大地豐富了肝炎病毒的多樣性。從我國(guó)賓川、祥云、景洪等地發(fā)現(xiàn)了大量的α冠狀病毒(Coronavirus, CoV)，基因分析這些αCoV可以形成5個(gè)進(jìn)化分支，且都是新型的αCoV;從我國(guó)德宏州的中菊頭蝠（Rhinolophus affinis）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了新型的βCoV，全基因組鑒定發(fā)現(xiàn)該病毒為更接近人的SARS冠狀病毒，而關(guān)鍵的受體結(jié)合域(Recep

11、tor binding domain，RBD)氨基酸序列同人的SARS冠狀病毒具有高度的一致性，瞬時(shí)表達(dá)S1結(jié)構(gòu)域和Western Blot分析發(fā)現(xiàn)該病毒能結(jié)合SARS病人的血清，從而從抗原性上證實(shí)該病毒與SARS病毒相關(guān);基因重組分析發(fā)現(xiàn)該病毒部分基因重組于同在云南省發(fā)現(xiàn)的蝙蝠SARS樣冠狀病毒Rs3367和Yunnan2011毒株，而人的SARS CoV可能是該病毒同蝙蝠SARS樣冠狀病毒Rp3株和Rf1株的重組體;從而給出更加確切

12、的證據(jù)證明蝙蝠就是SARS CoV的自然宿主。從我國(guó)云南省芒市的小蹄蝠體內(nèi)分離到一株新型的蝙蝠輪狀病毒(Group A Rotavirus，RVA)，獲得了該病毒的全基因組學(xué)序列，進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該病毒為新型的重組毒株，重組來源于不同的貓/犬源輪狀病毒(feline/caninerotavirus)，其中VP4和VP7等重要片段重組來自泰國(guó)的人流行株(CHM222)和印度的動(dòng)物源輪狀病毒;通過乳鼠接種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該病毒接種劑量為500T

13、CID50時(shí)對(duì)乳鼠具有100％的致死率，說明該病毒具有潛在的公共衛(wèi)生威脅。
　　本研究應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法對(duì)云南省及緬甸蝙蝠的病毒組調(diào)查。研究結(jié)果不僅豐富了該地區(qū)蝙蝠病毒數(shù)據(jù)庫(kù)，增強(qiáng)了我們對(duì)蝙蝠病毒多樣性的了解，而且系統(tǒng)獲得了這些地區(qū)蝙蝠攜帶病毒組的情況，發(fā)現(xiàn)了大量的新型病毒，為評(píng)估該地區(qū)蝙蝠病毒在公共衛(wèi)生中的威脅提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也反映出不同地域和種類的蝙蝠攜帶的病毒組具有明顯的差異。然而，本研究所發(fā)現(xiàn)的蝙蝠病毒僅僅為蝙蝠病

14、毒組學(xué)中的“冰山一角”，在未來需要對(duì)更多地方和更多種類的蝙蝠進(jìn)行病毒組學(xué)研究，才能真正了解蝙蝠病毒的多樣性。本研究同時(shí)也提供了一種新的病毒生態(tài)學(xué)調(diào)查方法:病毒宏基因組學(xué)與特異性PCR驗(yàn)證結(jié)合法。該方法首先用病毒宏基因組學(xué)調(diào)查樣本中病毒組，根據(jù)病毒組結(jié)果篩選感興趣的病毒，設(shè)計(jì)特異的PCR檢測(cè)方法篩查樣品，獲得樣品該病毒的攜帶率，同時(shí)也可以對(duì)該病毒進(jìn)行針對(duì)性的研究，該方法做到了有的放矢，大大降低病毒生態(tài)學(xué)調(diào)查的盲目性，在未來新發(fā)傳染病的預(yù)測(cè)