侵染藠頭的病毒種類鑒定及其部分病毒序列基因組特性分析.pdf

1、藠頭（Allium chinense G.Don）為百合科蔥屬多年生植物，其起源地為亞洲，是一種具有極高的經(jīng)濟價值的傳統(tǒng)蔬菜作物。而蓖頭病毒病是致使藠頭產(chǎn)量和品質(zhì)大幅降低的主要因素。本文在田間病害調(diào)查的基礎上，利用生物學、血清學以及病毒粒子形態(tài)和感病植物細胞病理特征觀察，結(jié)合分子生物學方法，對來自武漢江夏區(qū)的藠頭病毒樣品進行了種類鑒定，并對所獲病毒克隆基因組部分序列特性進行了分析，確定了該藠頭產(chǎn)區(qū)侵染的病毒至少包括三個屬4種病毒，主要研

2、究結(jié)果如下：
　　 1.明確發(fā)生在江夏區(qū)藠頭存在復合感染現(xiàn)象。通過在湖北省武漢市江夏區(qū)藠頭田間病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)田間菖頭植株表現(xiàn)為花葉、褪綠條紋、植株扭曲、黃化等癥狀；通過汁液摩擦接種到6種指示植物上，確定部分藠頭病毒病的繁殖寄主為昆諾藜；利用4個不同感病樣品的粗提液，經(jīng)負染后電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有3種不同的病毒粒子形態(tài)，包括桿狀、線型（歪曲和直線型）；直接采取感病蓖頭葉片制作超薄切片，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)感病寄主細胞質(zhì)內(nèi)含有大量的馬鈴薯Y病毒

3、屬（Potyvirus）成員特異的風輪狀（橫切）或柱狀（縱切）內(nèi)含體。
　　 2.首次發(fā)現(xiàn)侵染我國藠頭的馬鈴薯Y病毒屬OYDV病毒分離物。利用馬鈴薯Y病毒屬內(nèi)成員基因組簡并引物，結(jié)合通用引物M4，獲得該屬基因組3’端序列大小約1.7kb的擴增片段，對該片段進行了克隆和序列測定，其全長為1625個核甘酸，包括部分NIb（636bp）、全長CP基因（771bp）和3’端UTR序列。將所獲克隆基因組3’端核甘酸序列在數(shù)據(jù)庫比對分析，發(fā)

4、現(xiàn)所獲病毒克隆基因組3’端區(qū)域與洋蔥黃矮病毒（Onion vellow dwarf virus，OYDV）相同區(qū)域的核甘酸同源性最近，最高達99％。外殼蛋白基因的核甘酸和推測氨基酸序列與已報道的OYDV分離物CP相應區(qū)域同源性分別為80％-99％和87％-99％；構(gòu)建了CP基因核甘酸和編碼外殼蛋白氨基酸序列進化樹，結(jié)果顯示，所獲克隆基因組CP序列與來自大蒜上的OYDV云南分離物OYDV-YN2（GenBank登錄序列號AJ409313）

5、、兩個江蘇分離物OYDV-JS2（登錄序列號AJ409310）、OYDV-JS1（登陸序列號AJ293278）及日本分離物OYDV-Gzm（登錄序列號AB000840）相同區(qū)域同源性均很高（≥97％），聚成一簇。將該分離物暫命名為0YDV-WH，這是OYDV病毒侵染我國藠頭的首次報道。
　　 3.首次發(fā)現(xiàn)侵染我國藠頭的香石竹潛隱病毒屬7個不同克隆。利用香石竹潛隱病毒屬內(nèi)成員基因組簡并引物，結(jié)合引物M4，獲得該屬基因組3’端核甘酸

6、序列，共9個克隆，大小為1808-1812個核甘酸，序列特性分析表明，其包含病毒RNA基因組全長的第3-6共4個閱讀框（ORF）。序列比對顯示，這些克隆與現(xiàn)有報道的大蒜潛隱病毒（Garlic latent virus，GLV）基因組3’端相同區(qū)域的核苷酸序列最為接近，同源性分別在75％-82％之間，9個克隆中有7個克隆在該區(qū)域的核苷酸差異比較大，同源性在77％-93％之間。CP序列比對分析表明，所獲得克隆基因組CP序列與目前報道的GLV

7、基因組CP核苷酸和氨基酸同源性分別在75％-87％和88％-97％之間，其中克隆P2和car1-5基因組序列結(jié)構(gòu)最相似，與日本藠頭上的分離物GLV-Rjpn（登錄序列號AB004565）氨基酸同源性最接近，達97％。本研究獲得的具有較大序列差異的7個克隆之間基因組CP核苷酸和氨基酸的同源性分別76％-89％和88％-100％。外殼蛋白核甘酸序列進化樹分析表明，7個克隆分別與其他GLV分離物共形成4個不同進化族，其中P4克隆CP核甘酸進化

8、樹上形成獨立一族，且其核甘酸數(shù)量也有較大差異，因此，推測該克隆很可能為香石竹潛隱病毒屬的一個新種。將所獲的克隆基因組序列第3個ORF（編碼蛋白TGB2）、第4個ORF（編碼蛋白TGB3）和第6個ORF（編碼核酸結(jié)合蛋白NABP）分別與已知報道的GLV基因組對應區(qū)域序列進行比對分析表明，氨基酸序列同源性分別為71％-90％、59％-85％、82％-95％。ORF3、ORF4、ORF6基因變異比ORF5基因變異要大些，其中ORF4變異最大，

9、而ORF5變異主要發(fā)生在其編碼氨基酸的N末端。根據(jù)Carlavirus屬分類標準-不同病毒CP氨基酸同源性小于68％，同一病毒不同株系間為75％-90％。因此推斷本研究所獲得的克隆是屬于GLV不同的分離物。這是我國藠頭上的首次發(fā)現(xiàn)侵染GLV病毒。
　　 利用所獲病毒克隆基因組RNA3’端序列設計RNA基因組部分中間片段下游特異性簡并引物pCarl-2dW（-）和上游簡并引物pCare-2（+），RT-PCR擴增獲得包含病毒GLV

10、基因組的第2個ORF2及部分ORF1的片段。序列結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，ORF1和ORF2之間有30個核甘酸的非編碼區(qū)。ORF2與ORF3有23個核苷酸重疊區(qū)域。ORF2共含有708個核苷酸，編碼TGB1蛋白，將所獲病毒克隆基因組ORF2區(qū)域序列片段與現(xiàn)有報道的相關(guān)病毒相同區(qū)域比對分析，結(jié)果顯示該病毒基因組ORF2也存在較大的變異，核甘酸和氨基酸同源性分別在72％-78％和76％-83％。
　　 4.首次發(fā)現(xiàn)侵染我國蓖頭的利用蔥X病毒屬2

11、個不同病毒。利用蔥X病毒屬內(nèi)成員基因組簡并引物，結(jié)合引物M4，獲得該屬基因組3’端序列約1.0kb擴增片段，共8個克隆。其中克隆。pGTdw-8基因組3’端序列含有939個核甘酸，其它7個克隆均為949個核甘酸（代號為pGTdw-15），包括部分CP基因（441個核甘酸）、完整NABP全長基因381個核甘酸和3’端非編碼區(qū)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫Blast序列分析表明，克隆pGTdw-8基因組3’端序列與現(xiàn)有報道的蔥X病毒屬我國大蒜上發(fā)現(xiàn)的大蒜病毒E

12、（GarV-E，AJ292230）分離物相同區(qū)域核甘酸序列最相似，同源性達94％。另一個克隆pGTdw-15與大蒜病毒X韓國分離物（GarV-X，U892413）相同區(qū)域核甘酸序列最相似，具有91％的同源性，序列系統(tǒng)進化樹表明，本研究所獲蔥X病毒屬相關(guān)病毒克隆基因組3’端的核甘酸進化樹與完整的NABP核甘酸進化樹存在較大的進化族相關(guān)性和一致性。同時，基因組3’端UTR非翻譯區(qū)序列的比對結(jié)果顯示，本研究所得克隆pGTdw-8基因組3’端U