PRV感染Neuro-2a細(xì)胞中部分病毒基因組染色質(zhì)狀態(tài)與病毒增殖的相關(guān)性研究.pdf

1、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）也稱為Aujeszky’s disease virus（ADV）或suid herpesvirus type1，可引發(fā)偽狂犬病（PR）。PRV宿主譜廣泛，可感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物和一些禽類，而高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人不易感染。豬是PRV的天然宿主，感染的豬群成為PRV的天然儲(chǔ)藏器。2012年以來(lái)，PR在我國(guó)大面積流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此在養(yǎng)豬業(yè)偽狂犬病仍是疾病控制的一個(gè)重

2、點(diǎn)，對(duì)PRV感染機(jī)制進(jìn)行深入研究具有至關(guān)重要的意義。
　　核小體是構(gòu)成染色質(zhì)的基本單位，由145-147bp DNA纏繞著核心組蛋白八聚體構(gòu)成，相鄰核小體之間存在30-40bp DNA將這種基本結(jié)構(gòu)連在一起。核心組蛋白是由H2A、H2B、H3和H4的2倍體構(gòu)成八聚體。進(jìn)化上，核心組蛋白在生物間具有高度的保守性，尤其是H3和H4。1991年，Paul Laybourne和Kadonaga發(fā)現(xiàn)核心組蛋白（H2A、H2B、H3、H4）與

3、克隆的DNA形成核心核小體，并對(duì)基因活性產(chǎn)生溫和抑制效應(yīng)（約為4倍）。部分皰疹病毒感染宿主后，宿主細(xì)胞出于自身的防御，將自身組蛋白與病毒基因組組裝成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制病毒基因組的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。已報(bào)道的具有上述現(xiàn)象的皰疹病毒有人單純皰疹病毒1型（HSV-1）、人單純皰疹病毒2型（HSV-2）、水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）、人巨細(xì)胞病毒（HCMV）和人類皰疹病毒4型（EBV）。目前該現(xiàn)象在PRV感染過(guò)程中尚未發(fā)現(xiàn)，這為PRV感染機(jī)制的研究提

4、供新的方向。
　　染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）是一種研究體內(nèi)染色質(zhì)環(huán)境的方法。CHIP能夠在體內(nèi)捕獲與組蛋白H3相互作用的靶基因，精準(zhǔn)確定組蛋白H3在體內(nèi)的特定基因區(qū)域，對(duì)于研究組蛋白與基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的關(guān)系具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。此方法的建立可為探索PRV感染宿主細(xì)胞后，病毒基因組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與PRV基因組復(fù)制的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　基于上述背景，本文開(kāi)展了以下3個(gè)方面的研究，具體內(nèi)容如下：
　　1.偽狂犬病病毒gE基因SYB

5、R Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立
　　建立一種快捷、特異、敏感的檢測(cè)PRV的方法，為后續(xù)研究PRV在細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)提供可靠的檢測(cè)依據(jù)。本試驗(yàn)參照GenBank中已登錄的PRV Kaplan株的gE基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增并克隆目的片段，構(gòu)建陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立檢測(cè)PRV gE基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法（qPCR）。同時(shí)對(duì)該方法的特異性、敏感性及重復(fù)性進(jìn)行

6、驗(yàn)證。結(jié)果顯示，以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.99，在103-107拷貝/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該方法對(duì)常見(jiàn)的病毒檢測(cè)均為陰性，僅對(duì)PRV檢測(cè)為陽(yáng)性，特異性好。組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于3％，重復(fù)性好。本研究建立的PRV gE基因qPCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高以及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于后續(xù)PRV在Neuro-2a細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)的研究。
　　2.與組蛋白H3結(jié)合的鼠管家基因CHIP-qPCR方法的建立
　　

7、建立與組蛋白H3結(jié)合的鼠管家基因GAPDH的CHIP-qPCR方法，為后續(xù)PRV染色質(zhì)狀態(tài)的研究提供CHIP方法以及內(nèi)參基因做參考。利用甲醛交聯(lián)固定Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)，超聲波破碎將染色質(zhì)打斷成100-500bp的彌散片段后，采用組蛋白H3特異性單抗免疫沉淀該蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，再進(jìn)行解交聯(lián)，最后純化DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道的與組蛋白H3結(jié)合的鼠GAPDH引物，對(duì)免疫共沉淀的DNA樣品進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，驗(yàn)證鼠管家基因GAPDH

8、染色質(zhì)免疫共沉淀方法建立成功。結(jié)果顯示，最佳CHIP超聲條件為每次超聲時(shí)間6s，兩次間隔時(shí)間9.9s，功率150W，總時(shí)間20min。鼠GAPDH-pMD18重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.99，在103-107拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。qPCR結(jié)果顯示Ct=|Ct（鼠GAPDH）-Ct（IgG）|=11.14，符合CHIP-qPCR條件Ct=|Ct（鼠GAPDH）-Ct（IgG）|≥3。本研究成功建立與組蛋白H3結(jié)合的鼠GA

9、PDH的CHIP-qPCR方法，為后續(xù)PRV感染Neuro-2a細(xì)胞，病毒染色質(zhì)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　3.利用CHIP-qPCR研究與宿主組蛋白H3結(jié)合的PRV部分DNA序列與病毒復(fù)制的關(guān)系
　　首先根據(jù)試驗(yàn)一已建立的PRV gE qPCR方法，測(cè)定0.1MOI PRV感染Neuro-2a細(xì)胞12h內(nèi)病毒基因組的復(fù)制動(dòng)態(tài)。然后收集PRV感染Neuro-2a細(xì)胞的樣品進(jìn)行CHIP試驗(yàn)，通過(guò)qPCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)PRV部分DNA與組蛋