病毒鑒定的方法科四第5組

1、病毒的檢測手段和方法在不斷發(fā)展和改進，但無論是什么樣的方法，病毒所共有的兩個特性而發(fā)展起來的：一是病毒的侵染性。二是病毒作為核蛋白的特性，也就是病毒理化性質。,,,病毒鑒定的方法：,1、電子顯微鏡檢測法2、電鏡復染檢測法3、免疫電鏡檢測法4、血清學檢測法5、酶標免疫吸附法6、基因檢測技術7、蛋白指紋圖譜,1、電子顯微鏡檢測法 電子顯微鏡技術是最直接，最準確的檢測病毒的手段，

2、它可以直接看到病毒的形態(tài)結構、存在與否，所以在進入了分子水平的今天它仍然有著不可替代的作用。 原理：電子顯微鏡以電磁波為光源, 將感病植物組織制成檢測樣本, 利用短波電子流, 在電子顯微鏡下觀察, 可根據(jù)病毒的形態(tài)、大小、內(nèi)含體以及染病組織超微結構等診斷病毒的種類。,,返回,2、電鏡負染檢測法 電鏡負染技術是20世紀60年代開始使用于英國試驗室，其圖像如同一張照相的底片，因此人們習慣地稱為負染色，電鏡負染技術也就由此

3、而生。 原理：一些重金屬離子能繞核蛋白體四周沉淀下來，形成一個黑暗的背景，在核蛋白體內(nèi)部不能沉積而形成一個清晰的亮區(qū)，由此辨別病毒。,返回,3、免疫電鏡檢測法 免疫電鏡技術是將免疫學原理與電鏡負染技術相結合的產(chǎn)物，在電鏡制樣過程中，于銅網(wǎng)上先鋪展一層細胞色素A，稍后再添加一滴抗體，多余液滴用濾紙吸掉，最后點上一滴抗原和染液，由于細胞色素A的作用，減少了樣品即抗體、抗原的表面能力，能形成均勻的涂層。

4、 原理：在電鏡制樣過程中，病毒顆粒不能集中的沉積在有效的電鏡視野內(nèi)，而容易造成電鏡觀察時的疏漏，免疫電鏡法利用了抗體、抗原的親和性與吸附性的這一特點，使病毒能較集中地沉集在有效視野內(nèi)，從而便于電鏡下的觀察，提高了檢測幾率。,返回,4、血清學檢測法 動物受其致病細菌、病毒侵染后，動物體內(nèi)血液中的球蛋白發(fā)生變化而產(chǎn)生抗體，引起動物產(chǎn)生抗體的物質簡稱為抗血清。由于不同病毒產(chǎn)生的抗血清都有各自的特性, 因此可以用已知病毒的抗

5、血清來鑒定病毒種類。 原理：病毒是由蛋白質和核酸組成的核蛋白是一種很好的抗原, 血清中的抗體能與同系的抗原在體外特異的結合，使抗原失去活力。,返回,5、酶標免疫吸附法 該方法最早用于動物病毒的檢測，近二三十年才應用于植物病毒的檢測，并作為病毒的定量方法廣泛應用于病理、免疫學的研究和生產(chǎn)實踐中，對病毒進行快速檢測。此法的最大優(yōu)點是靈敏度高，很多的病毒因其濃度太低或某種抑制劑的干擾，常規(guī)血清學方法檢測不出時，此法就顯

6、示出獨特的優(yōu)越性。 原理：將同源特異抗體吸附在反應器皿底部，加入欲測試的含病毒的樣品，病毒與抗體結合，病毒顆粒被固定，再加入酶標記的特異抗體和酶的底物，酶與底物反應后會出現(xiàn)有顏色的溶液其強度與病毒濃度成正比，用此方法可測定出病毒的濃度。,返回,6、基因檢測技術 基因檢測技術對病毒的檢測已經(jīng)達到分子水平，其靈敏度和特異性是任何生化方法的檢測所不能比擬的，同時可以省略大量的病毒提純和血清的制備工作。 原理:（

7、1）分子探針雜交檢測技術，利用一定序列的核苷酸合成探針，通過分子雜交技術，檢測出供試樣品中與之相補的堿基序列。 （2）PCR技術是通過體外擴增可以使供試樣品中的目的基因片段很快擴增，使之達到了對即使是病毒含量極低的樣品，也能靈敏準確地得到定性的結果。,返回,PCR技術： 原理：PCR技術是一種在體外將特異性DNA序列進行高效擴增的方法。PCR擴增DNA片斷的特異性是由兩個人工合成的寡核昔酸引物的順序決定的,引物位于靶

8、DNA的兩側,并分別和相對DNA鏈互補。 步驟:①將待擴增標本(靶DNA)在高溫下變性, 雙鏈解離;②降低溫度,使兩引物結合到靶D NA上,兩個引物與靶DNA解鏈后的正負鏈互補;③在合適溫度條件下,在DNA多聚酶的催化下,引物引導DNA合成。,PCR技術：運用：A、用于遺傳性疾病，如鐮狀紅細胞貧血的診斷； B、用于艾滋病的檢測：目前艾滋病的診斷主要采用血清學方法檢查抗體,用PCR技術可在HIV感染早期血清未出現(xiàn)抗體

9、之前于血清中測得HIV-DNA,也可從病人外周血白細咆中測得極微量HIV-DNA。 C、用于乙型肝炎的檢測； D、用于輪狀病毒的檢測: 輪狀病毒為嬰幼兒急性病毒性胃腸炎的主要病原,PCR用于檢測糞便中的輪狀病毒比核酸雜交法, 敏感性提高5000倍。,返回,7、蛋白指紋圖譜法 原理：不同病毒蛋白通過一維sDs一PAGE分離能形成各自獨特的蛋白質帶型(或指紋圖譜)。病毒在感染細胞內(nèi)繁殖時，用高濃度NaCI特異

10、抑制感染細胞自身的蛋白合成，分離病毒蛋白后進行一維sDs一PAGE即可形成蛋自帶型(或指紋圖譜)，將待測病毒蛋白指紋圖譜與電腦內(nèi)病毒蛋白指紋圖參考軟件相比較即可鑒定未知病毒。 步驟:(1)培養(yǎng)病毒經(jīng)抑制宿主細胞合成后進行同位素標記。 （2）sDs一PAGE分離病毒蛋白。 （3）通過膠掃描對病毒蛋白指紋圖譜定位。 （4）抽提蛋白質且以數(shù)字的形式將蛋白指紋圖存入電膊硬盤，最后將未知病毒蛋自指紋圖與電