銀屑病治療藥物YXD09的非臨床實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、銀屑病是一種受多種因素影響的斑塊鱗屑性慢性炎癥性皮膚，以表皮增生過度及角化不全為主要特征，癥狀的嚴(yán)重程度不等，從較小的局部斑塊至累及全身。它具有反復(fù)性，難以根治。它影響到2％～3％的總?cè)丝冢侨蜃顬槌Ｒ姷淖陨砻庖呒膊≈?。它影響著全世界所有地區(qū)，在北美和歐洲，銀屑病是成年人中最普遍的免疫介導(dǎo)性皮膚病，影響著大約2500萬人。而在中國，銀屑病的患病率為0.123％，其中男性多于女性，北方多于南方，城市高于農(nóng)村。在非洲國家的發(fā)病率則比較低

2、。銀屑病的發(fā)病不但存在顯著的種族差異、性別差異，在地理和季節(jié)上差異也很顯著。高寒地區(qū)的發(fā)病率明顯高于溫暖地區(qū)，而冬春季病情可能加重夏季則自然減輕。
　　 現(xiàn)代的研究認(rèn)為銀屑病是一種多基因遺傳背景下的T細(xì)胞異常的自身免疫疾病，有關(guān)角質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等在銀屑病中的作用以及各種細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用等方面的探索和爭論不斷的揭示著其發(fā)病機(jī)理，推動著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，同時也促進(jìn)人們尋找更有效的抗銀屑病藥物，為人類的健康發(fā)展提

3、供支持。
　　 銀屑病的藥物治療按嚴(yán)重程度分別選用局部用藥物、光療法、傳統(tǒng)口服藥物和新型生物制劑。若患者的銀屑病對局部用藥物和光療法治療都無適當(dāng)響應(yīng)或疾病累及皮膚已十分廣泛，則需及時改用全身用藥物。傳統(tǒng)口服用銀屑病治療藥物主要有類維生素A類物質(zhì)、甲氨蝶呤（methotrexate）、環(huán)孢素(ciclosporin)和阿西曲汀(acitretine)等，它們治療銀屑病有效并具有使用簡便和價格低廉的優(yōu)勢，但對肝、腎和骨髓的毒性較大并

4、存在致畸性，實(shí)際應(yīng)用受到一定的限制。生物制劑與傳統(tǒng)全身用藥物相比，能夠特異性地靶向免疫系統(tǒng)因而具有更好的安全性和耐受性，所以適于用作更長期的銀屑病治療藥物。歐美至今已批準(zhǔn)了6種銀屑病治療用生物制劑。其中一類靶向與銀屑病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的T細(xì)胞，但由于療效差，目前臨床應(yīng)用已大為減少;另一類TNF抑制劑為治療中至重度銀屑病一線藥物。生物制劑對普通患者來說，價格昂貴，安全性仍然有限。
　　 中醫(yī)治療方法頗多，相應(yīng)地出現(xiàn)了很多的治療方藥，青

5、黛膠囊、雷公藤片、丹參注射液、清開靈注射液等在臨床應(yīng)用中得到了大力推廣，并獲得了良好的療效;其它一些復(fù)方中藥制劑和單味中藥提取物如銀杏葉內(nèi)脂、氧化苦參堿、喜樹果涂膜劑、去氫駱駝蓬堿軟膏等治療本病亦顯示出一定的效果和發(fā)展勢頭。由于中醫(yī)藥治療銀屑病可延長復(fù)發(fā)時間，不良反應(yīng)小，療效確切，其治療上的優(yōu)勢不容忽視。
　　 但是由于中藥復(fù)方有效成分不明確，并且目前中國藥典中藥復(fù)方質(zhì)量控制大多采用單一指標(biāo)成分定量的方法，該方法不能全面客觀的反

6、應(yīng)中藥內(nèi)在質(zhì)量，而且不符合中藥整體性的特點(diǎn)，存在一定的局限性。中藥制品質(zhì)量和安全性評價方法還不夠完善，不能實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量穩(wěn)定可控的要求，因此中藥復(fù)方至今未得到國際主流藥物市場的承認(rèn)。
　　 由于銀屑病的頑固性特點(diǎn)及中西藥在治療上的獨(dú)特缺陷，中醫(yī)中藥治療銀屑病具有廣闊的研究空間。在基礎(chǔ)研究方面，應(yīng)進(jìn)一步深化研究中醫(yī)藥內(nèi)外治療銀屑病的作用機(jī)理，建立中醫(yī)辨證分型的實(shí)驗(yàn)動物模型，統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)分型標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)室觀察指標(biāo)，更深層次闡明內(nèi)外用中藥制劑

7、的藥理學(xué)作用機(jī)制。由此，通過完善而系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究，以中醫(yī)辨證分型論治為基礎(chǔ)，以實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)為依據(jù)，開發(fā)出療效確切的中藥單體或復(fù)方，探索有效的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而闡明其作用機(jī)制，是今后中醫(yī)藥治療銀屑病實(shí)驗(yàn)研究的主要方向。
　　 鑒于銀屑病的特征及其治療藥物的研究現(xiàn)狀，更多地開發(fā)治療銀屑病的相關(guān)中藥制劑，在完善中藥研究資料、充分發(fā)揮中藥毒副作用小的優(yōu)勢的同時，盡可能提高其質(zhì)控水平、避免中藥的質(zhì)量評價與其作用整體性相違背的劣勢，對銀屑病治療藥

8、物發(fā)展具有重要意義。
　　 經(jīng)對銀屑病的特征、發(fā)病機(jī)制及銀屑病藥物治療現(xiàn)狀的認(rèn)識，通過對《中藥大辭典》相關(guān)組方的特性進(jìn)行研究，綜合國內(nèi)同類制劑的療效考察，我們進(jìn)行了銀屑病治療藥物的研究。
　　 本論文通過研究銀屑病治療藥物YXD09的組方，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)工藝優(yōu)化，運(yùn)用小鼠陰道上皮細(xì)胞模型、尾部皮膚鱗片模型和離體透皮試驗(yàn)，豐富本藥物的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)，完善其非臨床研究內(nèi)容，為銀屑病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

9、(1)銀屑病治療藥物YXD09的組方研究
　　 通過對銀屑病治療狀況的認(rèn)識，針對銀屑病的特征及發(fā)病機(jī)制，又根據(jù)《中藥大辭典》中各藥味的功能特性及應(yīng)用情況，建立銀屑病治療藥物YXD09的組方。
　　 (2)制備工藝優(yōu)化研究
　　 本試驗(yàn)選擇回流時間(A)、回流次數(shù)(B)、乙醇濃度(C)、乙醇用量(D)為考察因素，以大黃素含量為評價指標(biāo)，用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行試驗(yàn)。按十分之一處方量秤取藥材，共9份，按正交試驗(yàn)

10、方案進(jìn)行提取并濃縮至總體積的50％得YXD09，將濃縮液濾過，精密吸取濾過液20mL，以HPLC法測定YXD09中大黃素的含量。
　　 結(jié)果表明，影響最佳工藝的因素順序?yàn)?乙醇濃度＞回流時間＞回流次數(shù)＞乙醇用量，且最佳工藝參數(shù)為:C3A2B2D2。方差分析表明，4種工藝因素對大黃素的含量均沒有顯著差異（P＞0.05）。因而在實(shí)際生產(chǎn)中，為了降低生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)周期，將回流時間定為2小時，而不用4小時。因此，最后選擇的YXD09

11、醇提優(yōu)化條件為A1B2C3D2，即回流2小時，回流2次，乙醇濃度為80％，乙醇用量為8倍。
　　 選用大黃、羊蹄和虎杖3味中藥材及其余藥味考察合并醇提與分開醇提對大黃素含量的影響。結(jié)果顯示，合并醇提液和分開醇提液中的大黃素含量分別為162.78 ug/ml和161.22 ug/ml。采用EXCEL軟件對其結(jié)果進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)P＞0.05，說明兩種醇提液中大黃素的含量沒有顯著差異。
　　 (3)質(zhì)量控制研究
　　

12、 采用薄層色譜法對YXD09中大黃素和當(dāng)歸進(jìn)行了定性分析。依照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照品溶液3種溶液各10μl，分別點(diǎn)子同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30℃-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，將硅膠G薄層板置于365nm紫外光燈下檢視，對大黃和當(dāng)歸進(jìn)行薄層色譜鑒別。結(jié)果顯示，使用薄層色譜法鑒別YXD09中的大黃和當(dāng)歸，操作簡單，重現(xiàn)性好

13、，效果明顯，可以做為YXD09的薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn)。
　　 通過高效液相色譜法測定了YXD09中大黃素的含量。色譜條件是色譜柱:ZORBAX Extend-C18(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱;流動相:0-6min時，甲醇∶水(40∶60);6-20min時，甲醇∶水∶0.1％磷酸(75∶10∶15)，梯度洗脫;流速:1.0ml/min;檢測波長:254nm;柱溫:35℃。高效液相色譜法測定三個批次的YXD09中大黃素含量分

14、別為166.83、172.52、160.43μg/ml，RSD值分別為1.7％、1.3％、1.1％。
　　 首次采用了薄層色譜法，對YXD09中大黃和當(dāng)歸進(jìn)行了定性分析，通過方法學(xué)考察了高效液相色譜法可以簡便有效地測定YXD09中所含大黃素的總量，定性與定量相輔相成，檢驗(yàn)方法既全面可靠又具有一定的專屬性，為YXD09的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了基礎(chǔ)，尤其是對大黃素的檢測及含量測定，可以作為YXD09的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

15、>　　 同時又對大黃素及蛇床子素的同時定量方法進(jìn)行了研究。
　　 (4)藥效學(xué)研究
　　 利用小鼠陰道上皮細(xì)胞模型探討YXD09對雌激素周期小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響。選取造模成功的健康昆明種雌性小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只小鼠，分別為:YXD09組，陽性對照組，模型組;另隨機(jī)取沒有造模的健康昆明種小鼠10只，作為空白試驗(yàn)組。正式試驗(yàn)期為7d。第7d開始給藥:YXD09組采用自制陰道灌流器，每次灌注5分鐘;

16、空白組、模型組采用同樣方法灌流生理鹽水10mL/kg;陽性對照組于小鼠陰道壁均勻涂抹一層0.02％的丙酸氯倍他索軟膏。最后一次給藥1h后，各組小鼠于腹腔注射秋水仙堿15mg/kg，使有絲分裂終止在細(xì)胞分裂中期，取陰道標(biāo)本，置于10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，HE染色，于普通光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。結(jié)果表明，YXD09可抑制雌激素周期小鼠陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂，效果與丙酸氯倍他索軟膏相似（P＞0.05）。
　　 利用鼠尾鱗片表皮模型

17、探討銀屑凈對小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成的影響。選取體重相近、健康昆明種小鼠30只，隨機(jī)分為3組，分別為:YXD09組，陽性對照組，空白組，每組10只小鼠，公母各半。正式試驗(yàn)期為7d。分別在YXD09組小鼠尾部均勻涂抹一層相應(yīng)的藥物，陽性對照組小鼠尾部涂抹丙酸氯倍他索軟膏，空白組小鼠尾部則涂抹生理鹽水。在第7天處死小鼠，取小鼠尾部距離尾根約2cm處背面皮膚一長條，置于10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，HE染色，于普通光學(xué)顯微鏡下對每個標(biāo)

18、本逐個觀察鱗片，看鱗片表皮是否有顆粒層形成。結(jié)果表明，陽性對照組和YXD09組小鼠尾部含顆粒層鱗片所占比例均極顯著提高(P＜0.01)，分別提高70.1％、116.1％。YXD09的效果明顯優(yōu)于丙酸氯倍他索軟膏（P＜0.05）。
　　 這些結(jié)果提示，YXD09可能通過抑制表皮細(xì)胞的過度增殖和促進(jìn)表皮細(xì)胞角質(zhì)化來達(dá)到抗銀屑病的目的，并在抗銀屑病的臨床應(yīng)用具有廣闊的前景。
　　 (5)藥代動力學(xué)研究
　　 運(yùn)用SD大

19、鼠腹部皮膚作為皮膚模型，采用高效液相色譜法測定了YXD09中大黃素的單位面積累積透過量和皮膚滯留量，探討了YXD09的體外藥代動力學(xué)。采用水平式Franz擴(kuò)散池，擴(kuò)散池體積為3.5ml，有效擴(kuò)散面積為1.13cm2，恒溫水浴加熱，溫度控制在32℃左右，轉(zhuǎn)速為250rpm，接受介質(zhì)為30％PEG-生理鹽水，排除接受池中的氣泡，向擴(kuò)散池中加入3.5ml的YXD09藥液。分別于1，2，4，6，8，10，12，24h時取樣1ml，經(jīng)0.22μm