GmAOC3和GmMYC5轉(zhuǎn)化大豆的初步研究.pdf

1、大豆[Glycine max(L.)Merr.]是一種重要的經(jīng)濟和油料作物，但蟲害卻嚴重影響其成長和發(fā)育，使大豆產(chǎn)量和質(zhì)量嚴重降低。茉莉酸(JA)作為一種植物激素，在植物的脅迫防御反應中發(fā)揮著重要作用。在茉莉酸生物合成途徑中，丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOC)發(fā)揮著重要作用，其決定了JA的立體異構(gòu)型和生物活性。轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫中發(fā)揮重要的作用，在不利條件下，它們合成、傳輸和放大信號，進而調(diào)節(jié)下游基因的表達。遺傳轉(zhuǎn)化技術可以生產(chǎn)新穎和創(chuàng)造遺傳

2、多樣性的植物材料，為育種另辟蹊徑，因而在植物改良中有重要作用。所以，利用轉(zhuǎn)基因技術將具有抗蟲等作用的優(yōu)良基因?qū)氪蠖怪?，使其穩(wěn)定表達，這對大豆抗蟲種質(zhì)資源的增加具有重要意義。
　　本實驗首先利用雙酶切-連接的方法將吳倩(2011)和丁長文(2011)證明有抗蟲功能的基因GmAOC3和GmMYC5重新構(gòu)建植物表達載體pBA002-GmAOC3和pBA002-GmMYC5，其中含有篩選基因bar。再利用農(nóng)桿菌介導法將其轉(zhuǎn)入大豆中，實驗

3、結(jié)果顯示，單個事件轉(zhuǎn)化率為0～7.12％，總的轉(zhuǎn)化率分別為0.4％和0.3％，美國品種Jack優(yōu)于南農(nóng)88-1，而且整個子葉節(jié)的出芽率和轉(zhuǎn)化率均高于子葉節(jié)。T0代共收獲22株轉(zhuǎn)化苗，經(jīng)PCR和bar試紙條檢測陽性植株為5株，其中4株Jack，1株南農(nóng)88-1。利用PCR法、bar試紙條法和草丁膦葉片涂抹法檢測T1代轉(zhuǎn)化植株，共獲得轉(zhuǎn)GmAOC3大豆6株，轉(zhuǎn)GmMYC5大豆1株。定性PCR法主要檢測標記基因bar、35S+目的基因部分片段

4、、35S+目的基因+NOS-T。實驗還得出草丁膦的適宜涂抹濃度為150mg/L。
　　轉(zhuǎn)GmAOC大豆葉片半定量分析表明GmAOC3在轉(zhuǎn)基因Jack中表達量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株，表明在35S強啟動子作用下目的基因得到了高效表達，而在轉(zhuǎn)基因南農(nóng)88-1中卻沒有提高，可能是植物體內(nèi)復雜的調(diào)控網(wǎng)絡導致的。轉(zhuǎn)基因植株中，與茉莉酸代謝相關的基因表達趨勢不明顯，因而還有待進一步研究。轉(zhuǎn)基因植株熒光定量分析表明，bar基因多為單拷貝，少數(shù)為雙拷