靶向PEA-PPAR-α通路的新型NAAA抑制劑鎮(zhèn)痛抗炎作用及機(jī)制研究.pdf

1、據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，疼痛的全球發(fā)病率高達(dá)35-45％。由于疼痛種類多，誘因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，目前治療疼痛的藥物不僅非常有限，而且副作用較多，遠(yuǎn)未滿足疼痛治療的需求。新型、安全有效的鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)具有優(yōu)良的應(yīng)用前景及市場(chǎng)價(jià)值。
　　N-棕櫚酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide，PEA)是一種內(nèi)源性的脂質(zhì)，廣泛存在于神經(jīng)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等與炎癥、疼痛相關(guān)的組織細(xì)胞中。研究證明，PEA通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體

2、增殖物活化受體α(Peroxisomeproliferator-activated receptor，PPAR-α)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛抗炎的作用。PEA在組織及細(xì)胞中并不蓄積，而是受到相應(yīng)的合成酶及水解酶的調(diào)控維持正常水平。N-脂肪酰基乙醇胺水解酶(N-acylethanolamine acid amidase，NAAA)能特異性將PEA水解成棕櫚酸和乙醇胺，使其失活。NAAA歸屬于膽酰甘氨酸水解酶家族，主要分布于外周免疫系統(tǒng)，通過(guò)抑制NAAA活

3、性，能選擇性作用于外周免疫細(xì)胞，抑制PEA降解，通過(guò)激活PPAR-α發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎的作用，從理論上避免潛在的中樞副作用。
　　目前報(bào)道的NAAA抑制劑存在活性或穩(wěn)定性的不足，成藥性較差。β-丁內(nèi)酯類NAAA抑制劑雖然活性較高，但化合物本身穩(wěn)定性及生物穩(wěn)定性極差，無(wú)法用于口服或整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。為了解決這些問(wèn)題，本文通過(guò)建立NAAA抑制劑高通量篩選模型，從天然產(chǎn)物中篩選出具有一定活性的先導(dǎo)化合物，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾和改造，獲得了活性強(qiáng)、穩(wěn)定性高

4、的NAAA抑制劑，以系統(tǒng)給藥方式進(jìn)行鎮(zhèn)痛抗炎評(píng)價(jià)。本文應(yīng)用受體阻斷劑和基因敲除鼠，首次在動(dòng)物體內(nèi)證明了NAAA-PEA-PPAR-α通路在鎮(zhèn)痛抗炎中發(fā)揮的作用，為新型鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供了科學(xué)的思路和研究基礎(chǔ)。
　　本文主要完成以下三方面工作內(nèi)容:
　　一、NAAA抑制劑篩選模型的構(gòu)建
　　構(gòu)建HEK293-NAAA高表達(dá)細(xì)胞株，應(yīng)用LC-MS為檢測(cè)手段，建立NAAA抑制劑高通量篩選模型。應(yīng)用該模型，對(duì)傳統(tǒng)中草藥活性成分

5、及基于先導(dǎo)化合物的優(yōu)化產(chǎn)物進(jìn)行篩選評(píng)價(jià)。
　　二、?；量┩轭怤AAA抑制劑的抗炎作用研究
　　以?；量┩轭怤AAA抑制劑Compound16（IC50=2.12μM）為代表，應(yīng)用docking模型研究了其與NAAA活性催化中心的作用方式，發(fā)現(xiàn)Asn209殘基在水解中的作用;動(dòng)力學(xué)研究表明Compound16可逆、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制NAAA活性，通過(guò)抑制PEA的降解，顯著抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的表

6、達(dá)。
　　三、噁唑烷酮酰亞胺類NAAA抑制劑鎮(zhèn)痛抗炎及機(jī)制研究
　　對(duì)基于Compound16重新設(shè)計(jì)合成的新型噁唑烷酮酰亞胺類NAAA抑制劑進(jìn)行篩選評(píng)價(jià)，優(yōu)選出目標(biāo)化合物(Hits) F96(IC50=0.27μM)為可逆、競(jìng)爭(zhēng)性的NAAA抑制劑。F96的特點(diǎn)是第一個(gè)適用于整體動(dòng)物給藥的納摩爾級(jí)NAAA抑制劑。動(dòng)物腹腔注射給藥可顯著抑制TPA誘導(dǎo)的小鼠耳炎性腫脹、醋酸、福爾馬林誘導(dǎo)的炎性疼痛、以及小鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷