流感病毒神經氨酸酶的結構、耐藥及新型抑制劑作用的機制研究.pdf

1、流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，四次大流感的暴發(fā)和每年季節(jié)性流感的傳播嚴重威脅著人類健康并造成重大經濟損失，不時突現的高致病性禽流感時刻警示人類新一輪大流感暴發(fā)的潛在性。由此，流感病毒的不可預測性及其致病性致使防控流感成為研究的重點與難點。
　　 鑒于疫苗研發(fā)相對滯后，以流感病毒神經氨酸酶(NA)抑制劑為代表的抗病毒藥物成為迄今抵抗流感最有效的策略。NA的主要功能是促使新生病毒顆粒釋放并幫助病毒粒子在呼吸道粘液中遷移。A

2、型流感病毒NA的9種亞型依據一級結構序列可分為兩組：第一組(N1，N4，N5和N8)和第二組(N2，N3，N6，N7，N9)；近期新發(fā)現一種N10亞型，與前兩組NA差異較大。隨著對NA晶體結構的解析和酶活機制的了解，Zanamivir(Relenzar中文名：瑞樂沙)和Oseltamivir(Tamiflur中文名：達菲)等靶向NA的競爭性抑制劑被成功設計并開發(fā)成藥物，這一里程碑式的抗流感藥物研究被視為基于結構的藥物設計的成功范例。

3、r>　　 然而，Zanamivir口服生物利用率低，造成給藥不便；且隨著給藥的增多，Oseltamivir耐藥毒株頻現。這些缺陷使現有藥物的使用面臨瓶頸，新型抑制劑的研發(fā)需求迫切。本文主要利用結構生物學及生化手段開展了以下三方面的工作，為新型神經氨酸酶抑制劑的開發(fā)提供必要的理論依據：1）解析新型NA蛋白晶體結構；2）系統(tǒng)分析評價新型NA抑制劑的效果并探明其結構基礎；3）研究NA對現有藥物的耐藥機制。
　　 首先，2009甲型H

4、IN1大流感暴發(fā)后，本課題組在第一時間內通過桿狀病毒系統(tǒng)表達及純化了2009大流感病毒典型毒株的神經氨酸酶頭部區(qū)域重組蛋白(09N1)，并解析了其晶體結構。我們發(fā)現09NI（從序列上屬于第一組）缺乏傳統(tǒng)認為的第一組NA所特有的150-洞，這對經典的NA分組觀點提出了挑戰(zhàn)，因而我們將09N1歸為非典型的第一組NA成員。此后通過結構證明09N1雖不具備150-洞，卻可結合靶向150-洞的第一組NA特異性抑制劑IG-173，被IG-173“撐

5、開”形成殘缺的150-洞，再次證明了09N1的特殊性。進一步對09N1突變體的晶體結構及分子動力學模擬研究，揭示了09N1的149位氨基酸由Ile（第二組NA常見）突變?yōu)閂al（第一組NA常見）后增加了150-環(huán)鏈的柔性。
　　 其次，近期新型抗流感病毒NA藥物Laninamivir(lnavirr)及其前藥CS-8958在日本被批準使用，CS-8958具有長效保護機制，每周僅需一次給藥。我們系統(tǒng)分析評價了蛋白水平下四種NA藥物

6、(Laninamivir,CS-8958，Oseltamivir和Zanamivir)對不同組別NA的抑制活性，主要包括典型的第一組NA(N5)，典型的第二組NA(N2)和非典型的第一組NA(09N1)，并利用X射線晶體衍射手段闡明了四種藥物與NA作用的結構基礎。結果顯示Laninamivir對各組NA都有很強的抑制能力，且其抑制作用表現出組的偏好性，即對第一組NA的抑制效果更好。同時，我們首次發(fā)現了CS-8958與09N1及N2的作用

7、方式差異明顯，更為重要的是CS-8958/09NI表現出與NA/Oseltamivir類似的結合模式，這為Oseltamivir與不同組NA結合和耐受機制提出了新的視角。這些結果對Laninamivir及其前藥CS-8958的推廣有指導意義。
　　 另外，我們還對一種新型NA抑制劑MS-257(在Oseltamivircarboxylate骨架基礎上引入了Zanamivir的C4-胍基)對NA的抑制效果和結合模式進行了詳細分析，

8、MS-257可高效抑制多種流感病毒的NA重組蛋白，且對09NIH274Y突變株效果比Oseltamivir高約8倍，進一步探究其結構基礎，MS-257的4．胍基比Oseltamivir的4．氨基與NA結合更緊密，故對09NIH274Y的抑制效果更好。這些結果為MS-257的進一步開發(fā)提供了有利依據。
　　 此外，為全面系統(tǒng)分析A型流感病毒各種亞型NA的結構和功能特點，預防潛在的大流感暴發(fā)，本研究還開展了對豬流感毒株N3和高致病性

9、禽流感毒株N7以及新型N10的研究。對N3的序列和結構分析表明，不同于其它第二組NA，N3具有第一組NA特有的Y252殘基，且該殘基被認為是致使NIH274Y突變體產生Oseltamivir耐藥的關鍵因素。而體外活性實驗表明，N3H274Y突變體并未對Oseltamivir產生耐藥。進一步解析N3H274Y突變體及其與多種藥物的復合物結構，我們發(fā)現了不同于N1突變體的獨特Y274及W295構象。系統(tǒng)的結構比較揭示了造成這一構象差異的兩個

10、關鍵因素：240-環(huán)鏈，270-環(huán)鏈和290-環(huán)鏈間的氫鍵作用網絡強弱差異，以及W295與296位氨基酸能否形成開-兀相互作用。據此，我們提出了NIH274Y突變會導致Oseltamivir耐藥，而N3H274Y突變不會造成Oseltamivir耐藥的全新分子機制。N7和N10是最后兩個結構未知的A型流感病毒NA，現已成功表達純化出N7和N10重組蛋白并篩選出蛋白晶體，體外酶活實驗顯示N10無神經氨酸酶活性。
　　 總之，本研究